miRNA-149改善坐骨神经慢性压迫损伤大鼠神经病理性疼痛的机制研究

余艳丽，程小宁，薛静

1.陕西省核工业二一五医院输血科，陕西 咸阳 712000；2.陕西中医药大学第二附属医院儿童心肾病科，陕西 咸阳 712021；3.陕西中医药大学第二附属医院检验科，陕西 咸阳 712021

神经病理性疼痛(neuropathic pain，NP)是由外周或中枢神经系统疾病或躯体感觉神经系统受损引起的疼痛，主要特征是痛觉过敏、异常疼痛、自发性疼痛和感觉异常[1]。其发病率在持续增长，常常合并焦虑、抑郁、失眠等情感障碍[2]，严重影响患者的生活质量。目前，仍缺乏有效的治疗药物[3]。因此，明确NP 的分子机制对开发新型NP治疗药物有重要意义。

神经炎症是NP的病理基础。微小RNA(microRNA，miRNA)可以通过调节特定基因参与多种生物学过程(包括神经炎症)来影响NP 的发生[4]。据报道，miR-149 与多种神经疾病如阿尔兹海默症[5]、神经胶质瘤[6]、双向情感障碍[7]和椎间盘髓核细胞炎症[8]等的发生有关。此外，在骨关节炎[9]、非酒精性脂肪性肝病[10]、慢性阻塞性肺病[11]等炎症性疾病中miR-149 的表达下调，其过表达可抑制NF-κB 的激活来抑制炎症反应。由于疼痛的发生与多种神经疾病和炎症性疾病有着共同的神经病理学机制，且生物信息学预测显示miRNA-149 序列含有钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(calmodulin-dependent kinase Ⅱ，CaMKⅡ)γ的结合位点，而CaMKⅡγ已被报道在神经损伤的大鼠背根神经节(dorsal root ganglion，DRG)中存在异常表达[12]，在慢性疼痛相关的中枢敏化中起重要作用，参与疼痛调节[13-14]。因此，笔者推测miRNA-149可能参与疼痛的发生与维持过程。故本研究拟采用坐骨神经慢性压迫损伤(chronic constriction injury，CCI)诱导建立NP大鼠模型，综合运用疼痛行为学、组织病理学及分子生物学方法来逐步证明这一假说。

1 材料与方法

1.1 动物 从济南朋悦动物繁育有限公司[合格证号为SCXK(鲁)20140007]购入72只SPF级SD大鼠，雄性，体质量(200±20)g，质量合格证号为1107261911000134。所有动物饲养在温度为24℃，湿度为50%，12 h 明暗交替的环境中，可自由摄食和饮水。实验经陕西中医药大学第二附属医院动物实验伦理委员会批准(批准文号IACUC-G12007)。

1.2 主要仪器与试剂 BME-403 Von Frey、BME-410C全自动热痛刺激仪(中国医学科学院生物医学工程研究所)；BX53 荧光显微镜(日本Olympus 公司)；Leica confocal 118 SP5共聚焦显微镜(德国Leica 公司)。miR-149 agomir、CaMKⅡγ-pcDNA3.1、miR-149 mimic及其阴性对照agomir-NC、NC-pcDNA3.1、miR-NC(上海GenePharma 公司)；γ-干扰素(gamma-interferon，IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白细胞介素-1β (interleukin-1β，IL-1β) ELISA 试剂盒(上海酶联生物科技有限公司，批号：20190828、20190822、20190821)；尼氏(Nissl)染色液(北京Solarbio 公司，批号：G1436)；人肾上皮细胞HEK293T(中国Procell 公司，批号：CL-0005)；双荧光素酶报告基因检测试剂盒(美国Promega 公司，批号：E1910)；兔抗CaMKⅡγ抗体(美国Thermo Fisher Scientific 公司，批号：PA5-118989)；二抗山羊抗兔Alexa Fluor 647(英国Abcam公司，批号：ab150083)。

1.3 方法

1.3.1 动物模型建立 参照文献[15-16]方法建立CCI 模型。将72 只大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(CCI 组)、CCI+miR-149 agomir 阴性对照组(CCI+agomir-NC 组)、CCI+miR-149 agomir 组、CCI+miR-149 agomir+pc-NC 组、CCI+miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组，每组12 只。将大鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，固定于手术台上(俯卧位)，右侧后肢大腿去毛，酒精消毒，从大腿中部股骨外缘与股骨平行的方向，沿坐骨神经走行切开皮肤，钝性分离肌肉筋膜组织，分离坐骨神经主干，用4-0 缝合线间隔1 mm 结扎4 道线，结扎强度以下肢或足指轻微抽动为宜。结扎完成后缝合，肌肉注射青霉素预防感染。sham组仅暴露坐骨神经2～3 min，不结扎，其余操作同CCI组。

1.3.2 鞘内置管 麻醉大鼠后暴露腰L5～L6间隙，部分剔除L6棘突，暴露L5～L6间的三角间隙，用小针穿破硬膜，沿穿刺孔插入PE-10 导管(管口封闭)约1 cm，术后缝合，表示置管成功。于建模当天和建模后第3 天、第5 天、第7 天、第10 天对大鼠进行鞘内注射，CCI+agomir-NC组注射agomir-NC、CCI+miR-149 agomir组注射miR-149 agomir，CCI+miR-149 agomir+pc-NC组注射miR-149 agomir和CaMKⅡγ-pcDNA3.1阴性对照NC-pcDNA3.1，CCI + miR-149 agomir +pc-CaMK Ⅱγ 组 注 射miR-149 agomir 和CaMK Ⅱγ-pcDNA3.1，sham 组和CCI 组鞘内注射等量生理盐水，1次/d，注射体积为10 μL/次。

1.3.3 大鼠疼痛行为学评估 对于机械痛敏，实验前15 min将大鼠单独放置笼中以适应环境，开始实验时将电子Von Frey刺激针施加于大鼠右侧足底，记录大鼠迅速退缩或舔舐爪子的刺激强度，表示为机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。对于热痛敏，用热辐射照射大鼠右侧足底，大鼠出现快速抬足或舔足时停止，记录大鼠热刺激开始时间与出现抬足或舔足时间，两者的间隔时间即为缩足反射潜伏期(paw withdraw thermal latency，PWTL)，每只大鼠测量5 次，每次间隔5 min，计算其平均值。在建模前及建模后第3 天、第7 天、第11天、第14 天分别进行测定。

1.3.4 RT-qPCR 检 测 各 组miR-149、CaMK Ⅱγ mRNA 表达情况 每组随机取6 只，于建模后的第14 天分离L4～L6DRG 组织，采用Trizol 试剂提取组织总RNA，并逆转录为cDNA，进行PCR扩增：反应体系：2×UltraSYBR mixture 10.0 μL，cDNA 模板(25 ng/μL)2.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反应条件：在95℃下预变性5 min，然后是95℃15 s，60℃25 s和72℃30 s的40个循环。2-ΔΔCt方法计算基因相对表达。U6、GAPDH为内参对照。RT-qPCR引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 RT-qPCR primer sequence

1.3.5 Western blot 检测CaMKⅡγ蛋白表达水平 RIPA裂解液提取DRG组织总蛋白。蛋白浓度测定采用BCA法，将蛋白质样品(30 μg/泳道)用SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，并转移到PVDF 膜，将膜置于5%脱脂奶粉中封闭，随后在4℃下与一抗(CaMKⅡγ 1∶1 000，GAPDH 1∶5 000)孵育过夜，次日，将膜与HRP 标记的IgG 二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，ECL 显影，Image J软件分析蛋白质条带的灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达。

1.3.6 尼氏(Nissl)染色观察背根神经节神经元形态学改变 将分离的部分L4～L6DRG组织，在4℃下在4%多聚甲醛中后固定过夜，包埋在石蜡中，切成4 μm切片用于Nissl染色。切片用甲苯胺蓝溶液(Solarbio，北京)在50℃下染色30 min，然后用95%乙醇去除多余的染色。通过光学显微镜观察背根神经节神经元形态学变化，并用Image J软件分析尼氏小体平均吸光度值。

1.3.7 免疫荧光法检测脊髓神经元中CaMKⅡγ表达情况 取DRG 组织切片，二甲苯中脱蜡，浓度梯度乙醇水化，并在室温下用10%山羊血清和0.3%Triton X-100 封闭2 h，将切片与CaMKⅡγ(兔抗，1∶50)一抗在4℃下孵育过夜；然后，将切片与山羊抗兔Alexa Fluor 647(1∶200)偶联的二抗一起孵育以进行染色。DAPI染核，在PBS中洗涤3次后激光共聚焦显微镜观察切片。通过Image J 软件分析免疫荧光图像。每只大鼠切片随机选择3 个视野进行CaMKⅡγ染色细胞的计数。

1.3.8 ELISA检测TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平 每组剩余6 只大鼠，于鞘内注射后的第14 天，分离L4～L6 DRG，加入预冷的PBS溶液洗涤后，用预冷的生理盐水研磨后离心，取上清液，ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平。

1.3.9 靶基因预测和双荧光素酶报告基因实验miRDB数据库(http://www.mirdb.org/)预测miR-149与CaMKⅡγ的结合位点；广州辉骏生物科技有限公司构建miR-149与CaMKⅡγ结合的野生型CaMKⅡγ-WT及突变型载体CaMKⅡγ-Mut。将HEK293T细胞接种于96孔中(1 000个细胞/孔)，继续培养24 h，采用Lipofectamine 2 000 转染试剂将重组载体CaMKⅡγ-WT、CaMKⅡγ-Mut 分别与miR-149 mimic、miR-NC 共转染HEK293T 细胞。转染24 h 后收集并用细胞裂解液室温裂解细胞30 min，离心取上清液，使用双荧光素酶报告基因测定系统来评估荧光素酶活性。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-149在CCI大鼠DRG中的表达及miR-149过表达对CCI大鼠CaMKⅡγ表达的影响 RT-PCR结果显示，与sham 组比较，CCI 组大鼠DRG 中miR-149表达下降，CaMKⅡγ的mRNA 和蛋白水平升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CCI 组、CCI+agomir-NC组比较，CCI+miR-149 agomir 组大鼠miRNA-149 表达量增加，CaMKⅡγ的mRNA和蛋白水平降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CCI+miR-149 agomir组、CCI+miR-149 agomir+pc-NC 组比较，CCI+miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组CaMKⅡγ的mRNA 和蛋白水平升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见图1和表2。

图1 各组CCI大鼠DRG中CaMKⅡγ蛋白的表达Figure 1 CaMKⅡγ protein expression in DRG of CCI rats in each group

表2 miR-149在CCI大鼠DRG中的表达及miR-149过表达对CCI大鼠CaMKⅡγ表达的影响(±s)Table 2 Expression of miR-149 in DRG of CCI rats and the effect of miR-149 overexpression on CaMKⅡγ expression in CCI rats(±s)

表2 miR-149在CCI大鼠DRG中的表达及miR-149过表达对CCI大鼠CaMKⅡγ表达的影响(±s)Table 2 Expression of miR-149 in DRG of CCI rats and the effect of miR-149 overexpression on CaMKⅡγ expression in CCI rats(±s)

注：与sham 组比较，aP＜0.05；与CCI 组比较，bP＜0.05；与CCI+agomir-NC 组比较，cP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir 组比较，dP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir+pc-NC组比较，eP＜0.05。Note: Compared with sham group,aP＜0.05; compared with CCI group,bP＜0.05; compared with CCI+agomir-NC group,cP＜0.05; compared with CCI+miR-149 agomir group,dP＜0.05;compared with CCI+miR-149 agomir+pc-NC group,eP＜0.05.

组别sham组CCI组CCI+agomirNC组CCI+miR-149 agomir组CCI+miR-149 agomir+pc-NC组CCI+miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组F值P值只数6 6 6 6 6 6 miR-149 1.04±0.09 0.48±0.06a 0.50±0.07a 0.84±0.08abc 0.85±0.09abc 0.82±0.08abc 46.531 0.001 CaMKⅡγ mRNA 1.02±0.08 3.97±0.15a 4.03±0.18a 1.71±0.12abc 1.65±0.10abc 3.40±0.17abcde 549.575 0.001 CaMKⅡγ/GAPDH 0.25±0.04 1.17±0.08a 1.19±0.10a 0.42±0.07abc 0.40±0.06abc 0.98±0.09abcde 187.897 0.001

2.2 miR-149 过表达升高CCI 大鼠机械痛阈值比较 与建模前比较，建模后不同时间点CCI 组、CCI+agomir-NC 组、CCI+miR-149 agomir组大鼠机械痛阈值均下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与sham组比较，CCI组建模后各时间点大鼠机械痛阈值下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)；与CCI 组、CCI+agomir-NC 组 比 较，CCI+miR-149 agomir 组 建 模 后7 d、11 d、14 d 大鼠机械痛阈值升高，差异均具有统计学 意义(P＜0.05)；与CCI+miR-149 agomir 组、CCI+miR-149 agomir + pc-NC 组 比 较，CCI + miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组建模后7 d、11 d、14 d大鼠机械痛阈值降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 miR-149过表达升高CCI大鼠机械痛阈值比较(±s,g,n=12)Table 3 Comparison of mechanical pain threshold increased by miR-149 overexpression in CCI rats (±s,g,n=12)

表3 miR-149过表达升高CCI大鼠机械痛阈值比较(±s,g,n=12)Table 3 Comparison of mechanical pain threshold increased by miR-149 overexpression in CCI rats (±s,g,n=12)

注：与sham 组比较，aP＜0.05；与CCI 组比较，bP＜0.05；与CCI+agomir-NC 组比较，cP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir 组比较，dP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir+pc-NC组比较，eP＜0.05。Note: Compared with sham group,aP＜0.05; compared with CCI group,bP＜0.05; compared with CCI+agomir-NC group,cP＜0.05; compared with CCI+miR-149 agomir group,dP＜0.05;compared with CCI+miR-149 agomir+pc-NC group,eP＜0.05.

组别sham组CCI组CCI+agomir-NC组CCI+miR-149 agomir组CCI+miR-149 agomir+pc-NC组CCI+miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组F值P值建模前20.98±2.26 21.21±1.85 21.43±1.66 20.87±2.09 20.92±1.74 21.30±1.82 0.169 0.973建模后3 d 21.26±1.19 9.49±1.10a 9.86±1.07a 9.87±1.42a 9.90±1.26a 9.65±1.35a 172.925 0.001建模后7 d 20.21±1.21 7.25±0.80a 7.51±0.76a 12.43±1.25bc 12.48±1.20bc 9.87±1.14bcde 235.543 0.001建模后11 d 21.33±1.63 8.91±1.08a 8.67±1.01a 13.88±1.41abc 14.03±1.50abc 10.20±1.35ade 151.054 0.001建模后14 d 21.21±1.45 8.25±0.87a 8.48±0.95a 14.49±1.34abc 14.55±1.57abc 10.43±1.35ade 177.814 0.001

2.3 miR-149 过表达升高CCI 大鼠热痛阈值比较 与建模前比较，建模后不同时间点CCI 组、CCI+agomir-NC 组、CCI+miR-149 agomir 组大鼠热痛阈值均下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与sham 组比较，CCI组建模后各时间点大鼠热痛阈值下降，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CCI 组、CCI+agomir-NC 组比较，CCI+miR-149 agomir组建模后7 d、11 d、14 d大鼠热痛阈值升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CCI+miR-149 agomir组、CCI+miR-149 agomir+pc-NC组比较，CCI+miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组建模后7 d、11 d、14 d 大鼠热痛阈值降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 miR-149过表达升高CCI大鼠热痛阈值比较(±s,s,n=12)Table 4 Comparison of heat pain threshold in CCI rats increased by overexpression of miR-149 (±s,s,n=12)

表4 miR-149过表达升高CCI大鼠热痛阈值比较(±s,s,n=12)Table 4 Comparison of heat pain threshold in CCI rats increased by overexpression of miR-149 (±s,s,n=12)

注：与sham 组比较，aP＜0.05；与CCI 组比较，bP＜0.05；与CCI+agomir-NC 组比较，cP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir 组比较，dP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir+pc-NC组比较，eP＜0.05。Note: Compared with sham group,aP＜0.05; compared with CCI group,bP＜0.05; compared with CCI+agomir-NC group,cP＜0.05; compared with CCI+miR-149 agomir group,dP＜0.05;compared with CCI+miR-149 agomir+pc-NC group,eP＜0.05.

组别sham组CCI组CCI+agomir-NC组CCI+miR-149 agomir组CCI+miR-149 agomir+pc-NC组CCI+miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组F值P值建模后14 d 12.87±1.18 6.69±0.76a 6.75±0.73a 9.74±1.06abc 9.80±0.97abc 6.91±0.75ade 86.107 0.001建模前12.34±1.05 12.06±1.08 11.97±1.27 12.22±1.13 12.27±1.18 12.15±1.14 0.172 0.972建模后3 d 12.64±1.02 6.55±0.86a 6.42±0.83a 6.38±0.75a 6.40±0.80a 6.43±0.82a 106.389 0.001建模后7 d 12.53±1.10 6.42±0.78a 6.35±0.69a 8.69±0.97abc 8.72±0.90abc 6.64±0.71ade 89.512 0.001建模后11 d 12.44±1.09 6.55±0.81a 6.64±0.70a 9.20±0.96abc 9.24±0.95abc 6.79±0.77ade 81.056 0.001

2.4 miR-149 过表达减轻CCI 大鼠DRG 神 经元损伤 Nissl染色显示，sham组的DRG神经元显示出清晰的结构，尼氏小体丰富；与sham组比较，CCI组和CCI+agomir-NC组大鼠DRG神经元数量减少，尼氏小体明显减少，平均吸光度值降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，且CCI组与CCI+miR-NC组神经元损伤接近；与CCI+miR-NC组比较，CCI+miR-149 agomir组大鼠神经元状态明显好转，尼氏小体增多，平均吸光度值升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CCI+miR-149 agomir 组、CCI+miR-149 agomir+pc-NC 组比较，CCI+miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组神经元尼氏小体减少，平均吸光度值降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图2和表5。

图2 各组大鼠DRG的Nissl染色的代表性图像(放大倍数，×50；比例尺：200 μm)Figure 2 Representative images of DRGS in each group by Nissl staining(magnification,×50;scale:200 μm)

表5 各组大鼠DRG神经元尼氏小体平均吸光度值结果和CaMKⅡγ阳性神经元数量比较(±s，n=6)Table 5 Comparison of the average absorbance of the Nishi bodies of DRG neurons and the number of CaMKⅡγ positive neurons in each group(±s,n=6)

表5 各组大鼠DRG神经元尼氏小体平均吸光度值结果和CaMKⅡγ阳性神经元数量比较(±s，n=6)Table 5 Comparison of the average absorbance of the Nishi bodies of DRG neurons and the number of CaMKⅡγ positive neurons in each group(±s,n=6)

注：与sham 组比较，aP＜0.05；与CCI 组比较，bP＜0.05；与CCI+agomir-NC 组比较，cP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir 组比较，dP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir+pc-NC组比较，eP＜0.05。Note:Compared with sham group,aP＜0.05;compared with CCI group,bP＜0.05;compared with CCI+agomir-NC group,cP＜＜0.05;compared with CCI+miR-149 agomir group,dP＜0.05;compared with CCI+miR-149 agomir+pc-NC group,eP＜0.05.

组别sham组CCI组CCI+agomirNC组CCI+miR-149 agomir组CCI+miR-149 agomir+pc-NC组CCI+miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组F值P值0.65±0.07 0.21±0.03a 0.24±0.04a 0.51±0.05abc 0.53±0.06abc 0.34±0.04abcde 74.257 0.001 8.14±1.05 34.76±2.19a 35.05±2.25a 15.36±1.62abc 14.98±1.70abc 30.52±2.31abcde 225.607 0.001平均吸光度值CaMKⅡγ阳性神经元数量

2.5 miR-149 过表达对CCI 大鼠DRG 神经元CaMKⅡγ阳性表达的影响 与sham 组比较，CCI 组DRG 中CaMKⅡγ阳性神经元数量增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CCI 组比较，CCI+agomir-NC 组CaMKⅡγ阳性神经元数量差异无统计学意义(P＞0.05)；与CCI+agomir-NC 组 比 较，CCI+miR-149 agomir组CaMKⅡγ阳性神经元数量减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CCI+miR-149 agomir 组、CCI+miR-149 agomir + pc-NC 组 比 较，CCI + miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组CaMKⅡγ阳性神经元数量增加，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图3和表5。

图3 各组大鼠DRG中CaMKⅡγ的免疫荧光染色代表图(放大倍数，×100；比例尺：100 μm)Figure 3 Immunofluorescence staining of CaMKⅡγ in DRG of rats in each group(magnification,×100;scale:100 μm)

2.6 miR-149 过 表 达 降 低CCI 大 鼠DRG 中TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平比较 与sham组比较，CCI组TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平上升，差异均有统计学意义(P＜0.05)；CCI 组与CCI+agomir-NC 组的TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平比较差异均无统计学意义(P＞0.05)；与CCI+agomir-NC 组比较，CCI+miR-149 agomir 组TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)；与CCI+miR-149 agomir 组、CCI+miR-149 agomir + pc-NC 组 比 较，CCI + miR-149 agomir +pc-CaMKⅡγ组TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表6。

表6 miR-149过表达降低CCI大鼠DRG中TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平比较(±s,ng/mg,n=6)Table 6 Comparison of TNF-α,IL-1β,and IFN-γ in CCI rats decreased by overexpression of miR-149(±s,ng/mg,n=6)

表6 miR-149过表达降低CCI大鼠DRG中TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平比较(±s,ng/mg,n=6)Table 6 Comparison of TNF-α,IL-1β,and IFN-γ in CCI rats decreased by overexpression of miR-149(±s,ng/mg,n=6)

注：与sham 组比较，aP＜0.05；与CCI 组比较，bP＜0.05；与CCI+agomir-NC 组比较，cP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir 组比较，dP＜0.05；与CCI+miR-149 agomir+pc-NC组比较，eP＜0.05。Note: Compared with sham group,aP＜0.05; compared with CCI group,bP＜0.05; compared with CCI+agomir-NC group,cP＜0.05; compared with CCI+miR-149 agomir group,dP＜0.05;compared with CCI+miR-149 agomir+pc-NC group,eP＜0.05.

组别sham组CCI组CCI+agomir-NC组CCI+miR-149 agomir组CCI+miR-149 agomir+pc-NC组CCI+miR-149 agomir+pc-CaMKⅡγ组F值P值IFN-γ 0.93±0.15 3.22±0.28a 3.28±0.25a 1.85±0.21abc 1.90±0.22abc 3.04±0.27ade 99.950 0.001 TNF-α 2.54±0.51 9.66±0.87a 9.74±0.93a 5.31±0.64abc 5.37±0.60abc 8.85±0.79ade 95.316 0.001 IL-1β 0.84±0.13 2.65±0.24a 2.52±0.27a 1.57±0.18abc 1.61±0.20abc 2.43±0.19ade 71.362 0.001

2.7 CaMKⅡγ是miR-149 的靶标 miRDB 软件靶基因预测结果显示，miR-149 可靶向结合到CaMKⅡγ的3′UTR 区，见图4A。与转染miR-NC 比较，转染miR-149 mimic后，含有CaMKⅡγ-WT质粒的细胞荧光素酶活性下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，含CaMKⅡγ-Mut 质粒细胞的荧光素酶活性稍有降低，但差异无统计学意义(P＞0.05)，见图4B。

3 讨论

近年来，多项研究显示NP 中的miRNA (如miR-28-5p[17]、miR-146a-5p[18])存在异常表达，可能是NP干预的重要靶点。目前对miRNA-149的研究主要集中在癌症领域，miR-149 作为肿瘤抑制因子被认为是治疗癌症的候选靶点。而miR-149在NP 中的作用却未有研究报道。所以，希望通过本实验初步了解miR-149能否在NP的防治发挥作用。

本研究中，在CCI 大鼠痛阈值降低的同时miR-149的表达下调，且伴随着炎症因子TNF-α、IL-1β、IFN-γ水平的升高。据报道，miR-149 可通过靶向MyD88负调节巨噬细胞中TLR触发的炎症反应[19]；在IL-1β和IFN-γ共同处理的人胰腺β细胞中，miR-149表达下调，可诱导β细胞凋亡[20]，表明miR-149 参与炎症反应。本研究发现，过表达miR-149后，CCI大鼠的痛阈值升高，炎症因子水平降低。Nissl染色用于检查CCI大鼠DRG神经元损伤。尼氏小体被染成紫蓝色，大而多的尼氏小体表明神经细胞中的蛋白质合成很强，而受损神经元中的尼氏体减少或缺失说明神经细胞的蛋白质合成能力减弱。过表达miR-149 可以减少CCI 大鼠DRG 中细胞质空泡化，并增加Nissl 小体形成，减轻神经元损伤，提示miR-149 可抑制炎症反应减轻CCI大鼠NP。

为了确定miR-149 调节NP 进展的分子机制，本研究采用生物信息学软件miRDB 对miR-149 靶基因进行预测，发现CaMKⅡγ与miR-149 存在结合位点，为miR-149 的潜在靶基因。CaMKⅡ是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，最早是在中枢神经系统中发现的[21]，能够调节NF-κB 和炎症相关因子的产生[22]，与神经元损伤、疼痛调节密切相关[12-14]。CaMKⅡ有α、β、δ、γ四个不同的异构体，DRG 神经元表达所有亚型的mRNA，其中γ亚型的相对丰度高于α、β、δ。据报道，CaMKⅡγ的上调可导致NF-κB 信号通路的激活[23]。在弗氏佐剂(CFA)诱导的慢性炎性疼痛小鼠脊髓中CaMKⅡγ表达增加，下调其表达可逆转CFA诱导的热痛觉过敏和机械性疼痛以及脊髓神经元致敏[24]。此外，下调CaMKⅡγ可通过抑制NMDA受体改善吗啡中枢性疼痛的耐受性[11]。NMDA 受体是中枢神经系统内一类重要的兴奋性氨基酸，无论是在脊髓还是外周，均参与疼痛的发生、发展[25-26]。以上研究表明CaMKⅡγ与疼痛的调控过程密切相关。那么，CaMKⅡγ是否与miR-149对NP的改善作用有关？在本研究中，CCI术后大鼠DRG 中miR-149 表达的下调伴随着CaMKⅡγ mRNA和蛋白表达的升高，与既往的研究结果一致，因此，将CaMKⅡγ确定为进一步分析的对象。RT-qPCR和Western blot结果显示，过表达miR-149后，CaMKⅡγ表达降低；随后的免疫荧光双染结果再次证实过表达miR-149可降低脊髓神经元中CaMKⅡγ阳性表达。双荧光素酶报告结果进一步证实了miR-149与CaMKⅡγ之间存在靶向调控关系，提示CaMKⅡγ可能介导miR-149对NP的保护作用。为了进一步验证miR-149对CaMKⅡγ的调控作用，本研究在过表达miR-149的基础上采用CaMKⅡγ-pcDNA3.1 质粒转染来上调CaMKⅡγ表达，结果发现，上调CaMKⅡγ表达后，过表达miR-149对CCI大鼠NP的缓解作用被明显减弱，证实miR-149 可能通过靶向抑制CaMKⅡγ表达缓解NP。但是，NF-κB信号通路是否是CaMKⅡγ的下游信号通路有待进一步研究。

综上所述，过表达miR-149 可缓解CCI 大鼠NP，其作用机制可能与抑制CaMKⅡγ表达有关。本研究为NP的治疗提供新的靶点与理论依据。