黔中金荞麦提取物安全性评价及对大鼠肠道菌群的影响

张 涛，周思旋，唐远江，陶小艳，卢昱希，杜春林，王 鲁，齐维金，郭云勋，浦同灿

（1.贵州省农业科学院 贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005；2.贵州大学 贵州省生化工程中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省黔南布依族苗族自治州龙里县养殖业发展中心，贵州 龙里 551299；4.贵阳市花溪区农业农村局，贵州 贵阳 550025）

随着畜牧业的发展，人们对畜禽产品的需求已由量向质转变，生产绿色健康、优质的畜禽产品是畜牧业的长期目标。为避免养殖过程中因抗生素造成的细菌耐药性、药物残留、环境污染等问题，应尽量少用或不用抗生素类药物，我国农业农村部已颁布了减抗替抗相关法规，明确了抗生素减用和限用时间表。因此，寻找和开发低毒、低残留且能提高畜禽生长性能、免疫力和抗病力的中药制剂、植物提取物和益生菌等，是养殖行业健康发展的必然选择[1]。金荞麦[Fagopyrum dibotrys（D.Don）Hara]又名金锁银开、荞麦三七、赤地利等，为蓼科多年生药饲兼用草本植物，主要分布在我国西南地区[2]。金荞麦及其制剂和提取物中含有抗炎杀菌等活性成分，在动物饲养方面具有促生长、防疾病、提高肉品质及免疫功能等作用[3]。黔中金荞麦（Fagopyrum dibotrysQian Zhong）是以贵州黔中地区野生金荞麦为原始材料经优化栽培条件驯化而成的牧草新品种，该牧草产量高、营养价值高、适口性好[4]，生物活性成分丰富，具有抑菌、抗氧化、增强免疫力等功效[5-6]。贵州省畜牧兽医研究所兽用中草药课题组前期研究表明，黔中金荞麦表儿茶素、芦丁、槲皮素等黄酮类物质总含量高于野生金荞麦，其中槲皮素含量差异最为显著[7-8]；黔中金荞麦是一种亟待开发应用的饲料及饲料添加剂，其提取物地上和地下部分对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均表现出不同程度的抑制作用[9]。目前，对黔中金荞麦提取物的研究多集中在抑菌活性、提物工艺的优化、物质含量等方面，对安全性及其对肠道微生物区系的研究报道较少。鉴于此，通过急性毒性和亚慢性毒性试验对黔中金荞麦提取物的安全性进行评价，采用高通量测序比较高剂量黔中金荞麦水提物及醇提物对大鼠肠道菌群的影响，探究黔中金荞麦提取物的安全使用剂量范围及对大鼠肠道菌群的影响，以期为黔中金荞麦提取物临床应用及饲料添加剂研发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验动物

SPF 级昆明小鼠、SD 大鼠购自重庆腾鑫实验动物中心[动物许可证号：SCXK（京）2019-0008]，在贵州大学贵州省生化工程中心SPF 级动物实验室饲养，试验过程中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见（2006）》的规定。

1.2 黔中金荞麦提取物的制备

取黔中金荞麦粉适量，分别用料液比1∶40的水和70%乙醇浸泡过夜，70 ℃回流30 min，过滤，滤渣重提1 次，合并滤液，浓缩至浸膏恒质量，分别得到黔中金荞麦水提物和黔中金荞麦醇提物，备用。

1.3 黔中金荞麦提取物急性毒性试验

1.3.1 黔中金荞麦提取物对小鼠急性毒性预试验

选取健康的（20±2）g 昆明小鼠12 只，随机分成3组，每组4 只，雌雄各半，A 组为黔中金荞麦水提物组，B 组为黔中金荞麦醇提物组，C 组为生理盐水空白组，按生药40 g/kg 的最大给药剂量和20 mL/kg 给药体积一次灌胃给药，观察14 d，记录小鼠行为活动、精神状态及死亡情况。给药结束后，颈椎脱位方式处死小鼠，解剖观察并记录其脏器情况。

1.3.2 黔中金荞麦提取物对小鼠急性毒性限度试验 选取健康的昆明小鼠[（20±2）g]60只，随机分成3 组，每组20 只，雌雄各半，A 组为黔中金荞麦水提物组，B 组为黔中金荞麦醇提物组，C 组为生理盐水空白组，按生药40 g/kg 的最大给药剂量和20 mL/kg给药体积一次灌胃给药，观察14 d，记录小鼠行为活动、精神状态及死亡情况。给药结束后，颈椎脱位方式处死小鼠，解剖观察并记录其脏器情况。

1.4 黔中金荞麦提取物亚慢性毒性试验

1.4.1 动物分组及给药 选取提前检疫与驯化的健康状况良好的（180±2）g SPF 级SD 大鼠140 只，随机分为7 组，每组20 只，雌雄各半。黔中金荞麦水提物低（10 g/kg）、中（20 g/kg）、高（40 g/kg）剂量组，醇提物低（10 g/kg）、中（20 g/kg）、高（34 g/kg）剂量组和对照组（生理盐水20 mL/kg），每组灌胃给予相同剂量药物，每天给药1次，连续4周。

1.4.2 临床症状观察和质量测定 给药饲喂期间每天观察并记录大鼠的行为活动、外观体征、精神状况、粪便形状及颜色、下腹部，肛门处有无污物及排泄物等情况。分别于第0、2、4 周最后一天进行1次体质量测定，然后进行解剖。

1.5 检测指标

1.5.1 血液常规指标检测 末次给药后大鼠禁食16 h，按3 mL/kg 腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，经心脏采血，样品立即送至贵州安康医学检测中心进行血液学常规项目指标检测，主要有白细胞（WBC）、中性粒细胞（NEUT）、淋巴细胞（LYMPH）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）。

1.5.2 血清生化指标检测 处理同1.5.1，采集血样经室温静置1 h 后3 000 r/min 离心10 min，分离血清。样品送至贵州安康医学检测中心进行血清生化指标检测，主要有丙氨酸氨基转移酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酐（Crea）、总胆固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、葡萄糖（GLU）。

1.5.3 系统剖检、脏器系数及组织病理学检查 给药结束后，使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉进行剖检，检查脑、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、肾上腺、胸腺、雄性动物睾丸和附睾、雌性动物子宫和卵巢等脏器变化，并称其质量，计算各脏器质量与体质量之比（脏器系数）。将各组大鼠的肝脏、心脏、肾脏等脏器组织用4%甲醛固定、保存。将高剂量组和对照组的脏器组织按常规方法进行脱水、包埋、切片、HE染色后，光学显微镜观察。

1.5.4 肠道样品采集与微生物多样性分析 无菌操作分别收集黔中金荞麦提取物高剂量水提物组（R1）、高剂量醇提物组（R2）和对照组（R3）大鼠盲肠内容物。置于液氮保存，由北京诺禾致源生物信息技术有限公司进行16S rDNA高通量测序。

1.6 数据处理

体质量、血液学、血液生化、脏器系数以均数±标准差表示，采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析。利用Uparse 对肠道微生物进行聚类，采用Mothur 方法与SILVA 138 中SSU rRNA 数据库进行物种注释分析。基于分类操作单元（OTU）聚类结果，利用Qiime软件进行样本复杂度分析。

2 结果与分析

2.1 黔中金荞麦提取物急性毒性试验结果

将2 mg/mL 黔中金荞麦水提物和醇提物，按40 g/kg 一次灌胃小鼠，结果显示，观察14 d 内各组未发现小鼠死亡，期间小鼠精神状态良好，皮毛光泽，眼及黏膜无变化，呼吸无异常，未见中枢神经系统异常，采食饮水正常。剖解观察主要脏器组织，未见明显眼观变化。表明黔中金荞麦水提物和醇提物对小鼠最小致死量大于限度剂量（5.00 g/kg）。

2.2 黔中金荞麦提取物亚慢性毒性试验结果

2.2.1 大鼠临床症状与体质量变化 由图1 可见，黔中金荞麦提物各剂量组大鼠体质量随饲喂周期增加而增加，与对照组无显著性差异（P＜0.05）。给药期间黔中金荞麦水提物各剂量组和醇提物低、中剂量组大鼠正常饮水采食，精神状态良好，外观体征、行为活动未见异常；醇提物高剂量组大鼠表现为食欲不振、精神萎靡、采食及行为活动能力降低，至给药结束，该组大鼠死亡9只。

图1 黔中金荞麦提取物处理下大鼠体质量变化情况Fig.1 The curve of weight changes of rats affected by extracts of Fagopyrum dibotrys Qian Zhong

2.2.1 大鼠血液学指标检测 由表1 可见，与对照组比较，黔中金荞麦水提物各剂量组与醇提物中、高剂量组的大鼠WBC、NEUT、LYMPH、RBC、HGB及PLT 等相关指标均无显著性差异（P＜0.05）；醇提物低剂量组WBC 和LYMPH 显著性升高（P＜0.05），其余各指标无显著性差异（P＜0.05）。

2.2.2 大鼠血清生化指标检测 由表2 可见，与对照组相比，黔中金荞麦水提物低、中剂量组和醇提物低剂量组ALT、AST、TP等血清生化指标均无显著性差异（P＜0.05）。黔中金荞麦水提物高剂量组TP含量极显著降低（P＜0.01），TG 浓度显著增加（P＜0.05），其余各指标无显著性差异（P＜0.05）；醇提物中剂量组TP含量极显著降低（P＜0.01），BUN含量显著降低（P＜0.05），其余各指标无显著性差异（P＜0.05）；醇提物高剂量组除TG 无显著性差异（P＜0.05），ALB 含量显著降低、GLU 含量显著增加（P＜0.05），其余各指标均表现出极显著性差异（P＜0.01）。

表2 黔中金荞麦提取物对大鼠血液生化指标的影响Tab.2 Effects of extracts of Fagopyrum dibotrys Qian Zhong on blood biochemical indexes of rats

2.2.3 大鼠系统尸检、脏器系数检查 由表3和表4可见，与对照组比较，第4 周时，黔中金荞麦水提物和醇提物各剂量组SD 雄性大鼠心脏、肝脏、脾脏等组织脏器系数均无显著差异（P＜0.05）；黔中金荞麦醇提物中剂量组SD 雌性大鼠脾脏系数呈显著降低（P＜0.05），高剂量组呈极显著降低（P＜0.01），其余各剂量组均无显著差异（P＜0.05）。

表3 黔中金荞麦提取物对雄性大鼠脏器系数的影响Tab.3 Effects of extracts of Fagopyrum dibotrys Qian Zhong on organ coefficient of male rats

表4 黔中金荞麦提取物对雌性大鼠脏器系数的影响Tab.4 Effects of extracts of Fagopyrum dibotrys Qian Zhong on organ coefficient of female rats

2.2.4 高剂量黔中金荞麦提取物对大鼠组织病理学的影响 由图2可见，与对照组比较，高剂量黔中金荞麦水提物和醇提物组心脏未见明显与给药相关的异常病理改变（H-1、H-2 和H-3）。高剂量水提物组可见病变的肝脏组织，表现为肝小叶结构不清，肝细胞肿大，胞质疏松，有的凝固，细胞变性坏死，细胞核不清楚（L-2）；同时，肾脏组织中可见肾小管管腔结构不完整，有脱落坏死的变性上皮细胞组织（K-2）。高剂量醇提物组肾小管中可见皱缩细胞核，近、远曲小管管腔结构不完整，有大量脱落坏死的变性上皮细胞（K-3）。

图2 黔中金荞麦提取物对大鼠心、肝、肾组织病理切片的影响Fig.2 Effects of extracts of Fagopyrum dibotrys Qian Zhong on histopathological section of rat heart，liver and kidney

2.3 黔中金荞麦提取物对大鼠肠道微生物多样性的影响

2.3.1 序列拼接质控与OTU 聚类分析 经Illumina NovaSeq 测序分析得到细菌原始序列共225 324 条，有效序列共176 579 条，按照97%相似性进行聚类注释得到OTU 数共7 184 个。其中，R1、R2 和R3 平均原始序列分别为87 352、71 239、66 733 条，平均有效序列分别为72 094、54 801、49 684 条（表5）；聚类分析得到3 组样品OTU 分别为2 122、2 383、2 679个，特有的OTU 分别为202、328、382 个，共有的OTU为1 434个（图3）。

表5 黔中金荞麦提取物处理下大鼠肠道样品序列统计Tab.5 Sequence statistics of intestinal samples in different groups of Fagopyrum dibotrys Qian Zhong extracts

图3 不同处理组大鼠肠道菌群间OTU分布韦恩图Fig.3 Venn diagram of OTU distribution in intestinal bacteria of rats between different groups

2.3.2 黔中金荞麦提取物对大鼠肠道菌群Alpha 多样性的影响 据稀释曲线，随着测序深度的增加，样本序列数量不断增加时，OTU 数量逐渐趋于平缓，说明样本量充足，测序数据合理，能够较好地反映各试验组菌群信息（图4）。与对照组比较，R1 组Chao 1 和ACE 指数偏 低，R2 组Chao 1 和ACE 指 数增大；R1组和R2组Simpson 和Shannon指数均比R3小。根据Observed species 指数可得，细菌物种数目为R2＜R3＜R1。具体见表6。

表6 黔中金荞麦提取物对大鼠肠道微生物Alpha多样性指数的影响Tab.6 Effects of Fagopyrum dibotrys Qian Zhong extracts on alpha diversity index of rat intestinal flora

2.3.3 黔中金荞麦提取物对大鼠肠道菌群Beta 多样性的影响 对各组大鼠肠道内容物菌群多样性数据进行PCoA 分析见图5，结果显示，主成分PC1和PC2 的贡献率分别为总变量的46.72% 和15.43%，R1 组与R3 组的菌群特征接近，R2 组与另2组菌群特征相对较远。

图5 黔中金荞麦提取物处理下大鼠肠道菌群的PCoA分析Fig.5 PCoA analysis of intestinal flora of rats under treatments of Fagopyrum dibotrys Qian Zhong extracts

2.3.4 黔中金荞麦提取物对大鼠肠道菌群相对丰度的影响 由表7 可见，3 个组的优势菌群门类均为拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）。与R3 比较，R2 Firmicutes 相对丰度减少，R1 两个门类相对丰度均增加。属分类水平上，R1组主要有唾液乳酸杆菌属（Ligilactobacillus）、阿克曼菌属（Akkermansia）、罗姆布茨菌属（Romboutsia），其中Ligilactobacillus相对丰度最高（9.06%）；R2 组主要有拟杆菌属（Bacteroides）、Akkermansia、拟普雷沃菌属（Alloprevotella），其中Bacteroides相对丰度最高（37.67%）；R3 主要有Alloprevotella、杜氏乳杆菌属（Dubosiella）、Romboutsia，其中Alloprevotella相对丰度最高（5.91%）。

表7 黔中金荞麦提取物对大鼠肠道菌群相对丰度的影响Tab.7 Effects of Fagopyrum dibotrys Qian Zhong extracts on the relative abundance of intestinal flora in rats %

2.3.5 黔中金荞麦提取物处理下大鼠肠道菌群差异性分析 由图6 可见，经线性判别分析效应大小分析（LEfSe）筛选不同组差异显著的细菌群类，LDA＜4 水平上，共发现57 个菌群结构有差异。R1中有18 个标记性质物种，包括2 个门、4 个纲、3 个目、5个科、2个属和2个种，以梭菌纲（Clostridia）、颤藻目（Oscillosprales）和未鉴别细菌门为主；R2 中有10个标记性质物种，包括1个门、1个纲、1个目、2个科、2 个属和3 个种，以拟杆菌属（Bacteroides）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）和拟杆菌门（Bacteroidota）为主；R3 中有29 个标记性质物种，包括1 个界、3 个门、3个纲、6个目、5个科、6个属和5个种，以厚壁菌门（Firmicutes）、乳杆菌目（Lactobacillales）和杆菌纲（Bacilli）为主。在属水平上，R1 特征属为杜氏杆菌属（Dubosiella），R2特征属为拟杆菌属（Bacteroides），R3特征属为乳酸杆菌属（Ligilactobacillus）。

3 结论与讨论

植物提取物是经物理或化学方法从植物中提取得到的活性物质富集物，增加了药物成分，还可更好提取出不同极性、不同分子质量的活性成分，包括多酚类、黄酮类、多糖类等，充分发挥中药的功效。我国有着悠久的中药用药历史，中药资源丰富多样，药用植物及其提取物作为饲料添加剂、中兽药和绿色消毒剂等养殖投入品受到众多关注研究[10-11]。前人研究发现，波棱瓜子和赶黄草提取物可有效治疗因维生素A 急性中毒所致小鼠骨损伤，两者联合使用效果更佳[12]；以多叶勾儿茶、地榆、乌药、萹蓄入药的复方中药止痢散制剂可有效减缓番泻叶引起的小鼠腹泻，且长期服用未见明确的毒性反应[13]；肉鸡日粮中添加400 mg/kg 和600 mg/kg 的金银花提取物能提高肉鸡生产性能，提高胸肌中GSH-Px基因表达量及其相应的抗氧化酶活性，进而提高肌肉抗氧化性能，改善肌肉品质[14]。

黔中金荞麦为药饲兼用优质牧草，临床使用广泛，但其相关毒理研究资料缺乏，本试验对黔中金荞麦水提取物和醇提取物的急性毒性和亚慢性毒性进行研究，为临床用药提供数据基础。急性毒性试验是评价药物毒性最基本的方法，也是新药物生物安全评价的重要指标，可为后续亚慢性或长期毒性试验提供剂量参考[15-16]。本研究通过预试验确定黔中金荞麦水提物和醇提物灌胃剂量为2 mg/mL，一次灌胃小鼠剂量为40 g/kg。给药后小鼠精神状态良好，无明显不良反应及死亡，解剖亦无明显病变，说明40 g/kg黔中金荞麦水提物和醇提物无明显毒性，表明黔中金荞麦水提物和醇提物对小鼠最小致死量大于5.00 g/kg。本研究所用黔中金荞麦水提物和醇提物均为粗提物，其中大量有效成分目前还不明确，但结果显示无明显急性毒性，说明提取物具有较高的安全性。

亚慢性毒性试验是评价药物或毒物在一定时期内对机体产生危害的主要依据，可指导临床给药剂量。为探讨黔中金荞麦水提物和醇提物的亚慢性毒性作用，分别设低、中、高剂量连续对大鼠给药4 周，观察大鼠生长情况，测定血液常规、生化指标及脏器系数等。发现黔中金荞麦提取物各剂量组对大鼠体质量无不良影响，高剂量醇提物可致部分大鼠死亡，其余各组对大鼠外观行为无不良影响。与对照组比较，醇提物低剂量组白细胞和淋巴细胞显著性升高，中剂量组总蛋白极显著降低，尿素氮显著降低；醇提物高剂量组甘油三酯无显著性差异，白蛋白显著降低、葡萄糖显著增加，中、高剂量组雌性大鼠脾脏系数显著和极显著降低，血液学和脏器系数个别指标有一定的波动，但均在正常参考范围内[12]；高剂量水提物组大鼠甘油三酯显著增加，以上各指标均在正常参考范围内[17-19]。从组织病理学检测结果可知，长期灌胃高剂量黔中金荞麦水提物（40 g/kg）和醇提物（34 g/kg）后，大鼠心脏结构无明显病变，肝脏和肾脏结构均发现明显病变，但停药后是否恢复正常需进一步试验验证。

肠道微生物菌群直接影响机体健康状态、肠道功能、免疫能力等，与多种疾病相关，目前主要以抗生素或其他化学物质进行临床治疗，但这可能进一步产生包括药物残留、耐药性、食品安全等问题，故研究中药制剂、植物提取物和益生菌等对机体肠道微生物的影响对研制和开发兽药或饲料添加剂具有指导意义[20-24]。谭露霖等[25]饲喂以黔金荞麦1 号为主的中草药饲料添加剂可显著降低仔猪直肠粪便中大肠杆菌和沙门氏菌的数量，改善肠道微生物环境。本研究中，与对照组比较，高剂量水提物组大鼠肠道菌群丰度减少，醇提物组丰度增加，水提物组和醇提物组菌群多样性和物种均匀度均减少。表明饲喂黔中金荞麦提取物可调节大鼠肠道菌群多样性和物种丰富度。黔中金荞麦水提物、醇提物及对照组优势菌群门类均为拟杆菌门和厚壁菌门，拟杆菌门和厚壁菌门参与机体肠道重要的代谢活动，包括碳水化合物的发酵、含氮物质的利用以及脂肪酸和其他类固醇的生物转化，提高宿主的免疫力，促进肠道发育，还能够通过预防可能定植和感染肠道的潜在病原体感染使宿主受益[26-27]。黔中金荞麦水提物、醇提物及对照组最优菌属分别为唾液乳酸杆菌属（9.06%）、拟杆菌属（37.67%），拟普雷沃菌属（5.91%）。LEfSe 分析表明，与对照组比较，黔中金荞麦水提物组拟杆菌属、醇提物组乳杆菌属等有益菌相对丰度增加。

综上所述，黔中金荞麦水提物和醇提物为无毒物质；结合亚慢性毒性试验和病理组织观察，高剂量黔中金荞麦水提物（40 g/kg）和醇提物（34 g/kg）可影响大鼠肝脏和肾脏结构，停药后是否恢复需进一步试验验证；黔中金荞麦提取物可改变大鼠肠道菌群结构，调节菌群种类和数量，提高宿主的免疫力，促进肠道发育。