苯醚甲环唑对烟草赤星病菌的抑菌活性及烟叶叶际微生物的影响

张 艺，汪汉成，张兴红，张 林，郭沫言，3，向立刚，3，蔡刘体，王 丰

（1.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省烟草科学研究院，贵州 贵阳 550081；3.长江大学 农学院，湖北 荆州 434025）

由子囊菌亚门链格孢属真菌（Alternariasp.）引起的烟草赤星病（Tobacco brown spot）是烟草成熟期的主要病害[1]，在温湿度适宜的条件下，短时间内可大面积流行[2]，危害严重时多个病斑可连接成片，形成黑褐色大面积病斑。该病害常引起烟叶产质量下降，给烟农造成严重经济损失，其防治以化学防治为主。苯醚甲环唑（Difenoconazole）作为三唑类杀菌剂的典型代表，被全球多个国家登记用来防治链格孢属真菌引起的植物病害[3]。该药剂对烟草褐斑病[4]、苹果黑星病[5]、小麦纹枯病[6]均有较好的防治效果。它主要通过抑制羊毛甾醇转化为麦角甾醇过程中的羊毛甾醇或24-亚甲基二氢羊毛甾醇的C-14 去甲基化，抑制真菌甾醇的生物合成，破坏真菌细胞膜结构功能，达到杀菌目的，具有高效、广谱、低毒、用量低、内吸性强等特点[7-8]。苯醚甲环唑在我国西部烟叶产区已开始用于烟草赤星病和白粉病的防治。

烟叶叶际微生物与烟草叶斑类病害的发生密切相关，叶片作为微生物的主要栖息地，为叶际微生物的定殖提供了良好的生存环境[9-10]。目前，关于烟草赤星病危害期叶际真菌和细菌的菌群组成已有报道。刘亭亭等[11]研究发现，赤星病发生时不同成熟度烟叶叶际优势真菌均为链格孢属、枝孢霉属、亚隔孢壳属，优势细菌均为假单胞菌属和鞘氨醇单胞菌属。刘畅等[12]研究发现，感赤星病烟叶叶际细菌群落中存在大量泛菌属。DAI 等[13]研究发现，感赤星病烟叶叶际微生物菌群结构与烟叶叶位空间及烟叶成熟时间密切相关，但优势真菌主要为链格孢属、Symmetrospora、茎点霉属等。病害的发生会改变叶际微生物的群落结构与多样性，叶际微生物的菌群组成也会影响病害的发生；同时，叶际微生物的菌群结构也会受到外界环境的影响，特别是烟叶生产中施用的化学农药。已有研究发现，菌核净可显著抑制烟叶叶际鞘脂单胞菌属、黄色杆菌属和沙雷氏菌属菌群的丰度[14]，甲氧基丙烯酸酯类的醚菌酯在防治烟草赤星病的过程中可显著抑制链格孢属、假单胞菌属、泛菌属等菌属的丰度[15]。作为三唑类杀菌剂的典型药剂，苯醚甲环唑在烟草上正逐步推广应用，其对烟草赤星病菌的生物活性及对烟叶叶际微生物的影响规律仍不明确。为此，采用菌丝生长速率法测定了苯醚甲环唑对赤星病菌的毒力，并采用高通量测序技术和Biolog 代谢表型技术，分析苯醚甲环唑施药后健康烟叶与感赤星病烟叶叶际真菌和细菌的群落结构、多样性及代谢功能，旨在了解苯醚甲环唑对赤星病菌的生物活性及其施用后不同时间烟叶叶际微生物的变化规律。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试品种云烟105，购自云南省烟草公司玉溪市公司；10%苯醚甲环唑水分散粒剂（WDG），购自浙江一帆生物公司；烟草赤星病菌菌株CXB、A42及A54，均由贵州省烟草研究院真菌实验室提供；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；Biolog ECO 代谢板，购自美国Biolog 公司（USA，CA，Hayward）；GeneJET 胶回收试剂盒和Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒，均购自Thermo Scientific公司。

1.2 苯醚甲环唑对烟草赤星病菌的毒力测定

采用菌丝生长速率法[16]测定苯醚甲环唑对烟草赤星病菌菌丝生长的毒力。配制含系列质量浓度苯醚甲环唑的PDA 平板，苯醚甲环唑的最终测试质量浓度为0、0.01、0.05、1.25、6.25、31.25 mg/L，用直径6 mm 打孔器在赤星病菌菌落边缘打制菌饼，将菌饼接种至含药平板，每个处理设4 次重复。接菌后将其置于25 ℃生化培养箱中培养，待对照菌落长至2/3 平皿时，采用十字交叉法量取菌落直径，计算不同剂量苯醚甲环唑下的抑制率。以药剂质量浓度对数为横坐标，以抑制率概率值为纵坐标，建立苯醚甲环唑抑制烟草赤星病菌菌丝生长的毒力回归方程，计算药剂半数最大效应质量浓度（EC50）和相关系数。

1.3 施用苯醚甲环唑后烟叶叶际微生物菌群结构与代谢功能分析

1.3.1 试验设计 田间试验于2020 年8 月29 日至9 月16 日在贵州省威宁县黑石头镇进行，试验设置喷施10%苯醚甲环唑WDG和对照2个处理，选取烟株长势一致的烟田划分小区，各试验小区随机排列，每小区60 株烟株，每列20 株，共3 行，小区设3次重复，各小区之间设保护行。于烟叶底部叶片零星出现病斑时开始用药，试验地环境和烟株情况如图1 所示。10%苯醚甲环唑WDG 的用量为900 g/hm2，用水量为900 L/hm2，于早上9：00 采用多功能喷雾施肥器将配制的农药均匀喷施于叶片表面，直至液滴流失。并分别于施药前0 d 和施药后5、10、15 d在各小区随机选取10株烟株进行取样。

图1 烟草赤星病的田间症状Fig.1 Field symptoms of tobacco brown spot disease

1.3.2 样品采集 利用消毒剪刀分别剪取烟株中下部相同部位的感病与健康烟叶样品，分别装入50 mL 无菌离心管中，每个处理3 组重复。样品采集后放入低温保存箱，并迅速带回实验室开展试验，样品编号如表1所示。

表1 烟叶样品编号Tab.1 Tobacco leaf sample number

1.3.3 烟叶叶际真菌和细菌群落结构与多样性分析 采用CTAB[17]法提取烟叶叶际微生物基因组DNA，使用NanoDrop 2000 测定提取的DNA 浓度和纯度，检测合格后用于构建文库。以上述提取的总DNA 为 模 板，以 真 菌 引 物ITS1-5F-F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）和ITS1-1FR（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）对叶际微生物基因组DNA ITS1 区域进行PCR 扩增。以细菌引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′ ）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）对叶际微生物基因组DNA 16S-V4 区域进行PCR 扩增。PCR 扩增体系与反应程序参照HUANG 等[18]、CHEN等[19]的方法进行。扩增产物回收后，使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建库试剂盒构建文库，采用Illumina MiSeq 测序平台对PCR 扩增产物进行双端测序，以上分析均在北京诺致源科技股份有限公司完成。

1.3.4 烟叶叶际微生物代谢功能分析 分别取施药前后中下部相同部位的感病与健康烟叶样品各1 g，将其置于盛有50 mL 0.8%无菌生理盐水的100 mL三角瓶中，28 ℃下以180 r/min振荡培养2 h，取出后静置30 min，取100 μL 上清液依次分别加至ECO 代谢板的测试孔中，将ECO 代谢板置于OmniLog 恒温培养箱，28 ℃培养7 d，采用Biolog D5E_OKA_data.exe 软件收集烟叶叶际微生物在生长过程中代谢孔内颜色变化值，收集后使用HemI软件制作热图，分析样品叶际微生物的代谢功能[20]。

1.4 数据处理及统计分析

使用Excel 2019、SAS 2019 软件进行数据处理及统计分析。测序数据通过FLASH 和Trimmomatie软件进行过滤优化和双端序列连接。过滤优化后的序列使用UPARSE 软件（Version 7.1）对相似度≥97%的序列进行OTU（Operational taxonomic units）聚类，并在聚类过程去除单序列和嵌合体。真菌和细菌分别通过Unit（7.2）和SILVA 132 的SSUrRNA数据库进行注释。采用Qime（Version19.1）软件计算Alpha 多样性指数，运用SAS 9.3 对真菌和细菌的Alpha 多样性指数进行差异显著性分析。利用R 语言工具统计并绘制物种积累箱形图、门属水平相对丰度图，分析样品微生物群落结构与多样性。

2 结果与分析

2.1 苯醚甲环唑对烟草赤星病菌的毒力

如表2 所示，苯醚甲环唑对3 株烟草赤星病菌菌丝生长均具有较强的抑制活性，随着药剂质量浓度的增加，其抑制作用逐渐增强。苯醚甲环唑抑制菌丝生长的EC50值为0.09～0.26 mg/L，平均值为0.17 mg/L，其相关系数均大于0.98。

表2 苯醚甲环唑对烟草赤星病菌的毒力Tab.2 Toxicity of difenoconazole to Alternaria alternata

2.2 施用苯醚甲环唑后烟叶叶际微生物菌群结构与代谢功能

2.2.1 真菌和细菌群落结构 在门水平上，施药前后感赤星病烟叶与健康烟叶的真菌群落优势菌群均为子囊菌门（Ascomycota），其次是担子菌门（Basidiomycota），施药前后感赤星病烟叶的子囊菌门相对丰度均高于施药前后的健康烟叶。施药前感赤星病烟叶子囊菌门相对丰度为93.79%，施药5、15 d 时，其相对丰度分别降低6.34、1.40 百分点，施药10 d 时升高2.47 百分点。施药前健康烟叶子囊菌门相对丰度为63.26%，施药5、10 d 时，其相对丰度分别降低16.90、21.84 百分点，施药15 d 时升高9.75 百分点。感赤星病烟叶施药5、15 d 时，担子菌门相对丰度升高，10 d 时降低，健康烟叶施药5 d 时担子菌门相对丰度降低，10、15 d 时相对丰度均升高（图2A）。

图2 施用苯醚甲环唑后烟叶叶际真菌、细菌门和属水平的群落组成Fig.2 Community composition of phyllospheric fungi and bacteria at phylum and genus levels in tobacco leaves after application of difenoconazole

在属水平（图2B）上，施药前后感赤星病烟叶与健康烟叶的真菌群落主要菌属为链格孢属（Alternaria）、Boeremia、枝孢霉属（Cladosporium）、Symmetrospora、亚隔孢壳属（Didymella）、附球菌属（Epicoccum），其中链格孢属为优势菌属，施药前感赤星病烟叶中链格孢属相对丰度（84.24%）远高于健康烟叶（36.27%）。施药5 d 时，感病与健康烟叶中相对丰度降低的菌属为链格孢属（分别降低14.06、18.37 百分点）、枝孢霉属（5.88、13.63 百分点）、Symmetrospora（1.74、4.21 百分点）、附球菌属（0.07、0.07百分点）、亚隔孢壳属（0.07、1.98百分点）及感病烟叶中Boeremia（0.33 百分点）；感病与健康烟叶中相对丰度升高的菌属为圆孢霉属（Staphylotrichum，分别升高5.21、12.96 百分点）、曲霉属（Aspergillus，3.01、0.33 百分点）、Chlamydomyces（2.07、0.87 百分点）及健康烟叶中的Boeremia（3.61百分点）。施药10 d 时，感病与健康烟叶中相对丰度降低的菌属为Boeremia（0.33、5.21 百分点）、枝孢霉属（6.15、13.96 百分点）、Symmetrospora（1.94、2.61百分点）、亚隔孢壳属（0.33、1.27 百分点）及健康烟叶中的链格孢属（24.51 百分点）、附球菌属（0.60 百分点）；感病烟叶中相对丰度升高的菌属为链格孢属（10.17 百分点）、附球菌属（0.13 百分点），健康烟叶中为圆孢霉属（19.70 百分点）、Chlamydomyces（0.20百分点）、曲霉属（0.47百分点）。施药15 d时，感病与健康烟叶中相对丰度降低的菌属为枝孢霉属（4.94、9.22 百分点）、Boeremia（0.13、0.13 百分点）及感病烟叶中的链格孢属（4.23 百分点）；感病与健康烟叶中相对丰度升高的菌属为Symmetrospora（2.14、4.34 百分点）、亚隔孢壳属（2.45、0.07 百分点）、附球菌属（3.21、2.54 百分点）及健康烟叶中的链格孢属（19.10百分点）、曲霉属（1.07百分点）。

在门水平上，施药前后感赤星病烟叶与健康烟叶的细菌群落优势菌群均为变形菌门（Proteobacteria），其次是厚壁菌门（Firmicutes），且施药前后感赤星病烟叶的变形菌门相对丰度均高于施药前后的健康烟叶。施药前感赤星病烟叶变形菌门相对丰度为38.37%，施药5、10 d 时，其相对丰度分别降低22.03、12.64百分点，施药15 d时升高53.02 百分点；施药前健康烟叶变形菌门相对丰度为6.71%，施药5、10 d时，其相对丰度降低3.25、1.90百分点，施药15 d 时升高27.29 百分点。感赤星病烟叶施药5、10 d 时，厚壁菌门相对丰度升高，15 d时降低，健康烟叶施药5、10、15 d 时，厚壁菌门相对丰度均降低（图2C）。

在属水平上，施药前后感赤星病烟叶与健康烟叶的细菌群落主要菌属为泛菌属（Pantoea）、假单胞菌 属（Pseudomonas） 、鞘 脂 单 胞 菌 属（Sphingomonas）、马赛菌属（Massilia），其中泛菌属为优势菌属，施药前感赤星病烟叶中泛菌属相对丰度（22.93%）远高于健康烟叶（6.48%）。施药5 d 时，感病与健康烟叶中相对丰度降低的菌属为泛菌属（分别降低22.14、6.49 百分点），感病烟叶中的马赛菌属（1.68百分点）、鞘脂单胞菌属（6.04百分点），以及健康烟叶中的魏斯氏菌属（15.55 百分点）；感病与健康烟叶中相对丰度升高的菌属为假单胞菌属（分别升高5.21、1.56 百分点）及健康烟叶中的马赛菌属（0.22 百分点）。施药10 d 时，感病与健康烟叶中相对丰度降低的菌属为泛菌属（22.60、6.27 百分点）及感病烟叶中的马赛菌属（1.34 百分点）、鞘脂单胞菌属（6.26 百分点）；感病与健康烟叶中相对丰度升高的菌属为假单胞菌属（14.99、2.01 百分点）。施药15 d 时，感病与健康烟叶中相对丰度增加的菌属为泛菌属（14.32、2.46 百分点）、假单胞菌属（24.72、4.14百分点）、鞘脂单胞菌属（4.03、1.90百分点）、马赛菌属（3.24、1.79 百分点），主要菌属相对丰度均增加（图2D）。

2.2.2 真菌和细菌群落Alpha 多样性 真菌群落中，苯醚甲环唑处理前后感病烟叶与健康烟叶的覆盖度指数在0.92 以上；细菌群落中，苯醚甲环唑处理前后感赤星病烟叶与健康烟叶的覆盖度指数在0.87 以上，表明样本中序列被检测出的概率高，测序结果能够反映样本中实际的真菌和细菌群落结构。Chao1 指数反映真菌群落结构的丰富度，Shannon 指数反映真菌群落结构的多样性。对烟叶微生物多样性进行评估（表3）可知，在真菌群落结构中，施药前后感病烟叶的叶际微生物群落多样性和丰富度指数均低于健康烟叶，且存在显著差异。施药5 d 时，感病烟叶与健康烟叶多样性指数和丰富度指数均升高；施药10 d 时，感病烟叶多样性指数降低，丰富度指数升高，健康烟叶多样性指数和丰富度指数升高；施药15 d 时，感病烟叶多样性指数升高，丰富度指数降低，健康烟叶多样性指数降低，丰富度指数升高。

表3 施用苯醚甲环唑后烟叶叶际真菌和细菌Alpha多样性（OTU水平）Tab.3 Alpha diversity of phyllospheric fungi and bacteria in tobacco leaves after the application of difenoconazole（OTU level）

在细菌群落结构中，感病烟叶与健康烟叶施药后叶际微生物群落多样性和丰富度指数均高于施药前，施药前后感病烟叶的多样性指数均高于健康烟叶，且存在显著差异。感病烟叶施药5、10、15 d时，多样性指数和丰富度指数均升高（表3）。

由物种积累箱形图可知，真菌OTU 数目接近400，细菌OTU 数目接近300 时，随着样本量的加大，箱形图位置趋于平缓，表明此环境中的物种并不会随样本量的增加而显著增多，说明抽样充分，可以进行数据分析（图3）。

图3 烟叶样品真菌（A）、细菌（B）OTU水平物种积累箱形图Fig.3 Box diagram of species accumulation of fungi（A）and bacteria（B）at OTU level in tobacco leaf samples

2.3 感赤星病烟叶叶际微生物代谢功能

采用Biolog-ECO 代谢板对施药前后烟叶样品进行代谢功能分析，Biolog-ECO 代谢板中含有碳水化合物类、羧酸类、酚酸类、氨基酸类、胺类、多聚物类共31 种碳源。施药前，感病烟叶叶际微生物对L-苏氨酸、D，L-α-甘油、α-丁酮酸、α-环式糊精代谢较弱，对其他碳源代谢相对高效，尤其是对D-甘露醇、L-天冬酰胺、吐温80、吐温40。施药5 d时，感病烟叶叶际微生物对α-丁酮酸代谢增强，对其余碳源代谢均减弱，其中对D-木糖的代谢最弱。施药10 d 时，相较于施药前，感病烟叶叶际微生物对α-丁酮酸和L-苏氨酸代谢增强，其余碳源代谢均减弱，对2-羟基苯甲酸代谢明显减弱；相较于施药5 d时，对α-丁酮酸、D，L-α-甘油、丙酮酸甲酯、D-葡萄糖胺酸、4-羟基苯甲酸、苯乙基胺6种碳源代谢程度保持不变，仅2-羟基苯甲酸代谢被抑制，其余碳源代谢程度均增强，但代谢程度一般。施药15 d时，相较于施药前，感病烟叶对葡萄糖-1 磷酸盐、D-葡萄糖胺酸代谢保持不变，对α-丁酮酸、L-苏氨酸、α-环式糊精3种碳源的代谢增强，对其余碳源的代谢被抑制，其中对D-木糖、4-羟基苯甲酸、2-羟基苯甲酸的代谢被抑制较为明显；相较于施药10 d时，感病烟叶对D-木糖、D，L-α-甘油代谢保持不变，对4-羟基苯甲酸的代谢被抑制，其余碳源代谢均增强（图4）。

施药前健康烟叶对α-丁酮酸、2-羟基苯甲酸代谢强度较弱，对其他碳源均可高效代谢。施药5 d时，相较于施药前，对所有的碳源代谢均降低，其中对α-丁酮酸、2-羟基苯甲酸、腐胺的代谢被抑制较为明显。施药10 d 时，相较于施药前，对D-纤维二糖、D-葡萄糖胺酸的代谢程度保持不变，除α-丁酮酸，对其余碳源的代谢均减弱，以2-羟基苯甲酸代谢受抑制较为明显；相较于施药5 d 时，对所有碳源代谢均增强。施药15 d 时，相较于施药前，对D-纤维二糖、α-D-乳糖、I-赤藓糖醇、L-精氨酸的代谢保持不变，对其余碳源的代谢均减弱；相较于施药10 d时，对D-木糖、α-丁酮酸、D-葡萄糖胺酸、4-羟基苯甲酸的代谢减弱，对D-纤维二糖、D-半乳糖酸内酯、D-半乳糖醛酸等8种碳源的代谢强度保持不变，对其余碳源的代谢均增加（图4）。

3 结论与讨论

本研究中，苯醚甲环唑对烟草赤星病菌菌丝生长的EC50值为0.17 mg/L，活性较高。这可能与苯醚甲环唑的作用机制有关，其通过抑制病原菌麦角缁醇的生物合成而干扰病菌的生长，对植物病原菌的菌丝生长具有较强的抑制作用，被广泛应用于由子囊菌、担子菌和半知菌引起的植物病害防治[21-22]。因此，该药剂适合作为烟草赤星病的治疗性药剂，能高效抑制病斑的扩展。

叶际微生物在维持生态系统平衡和叶片健康方面均具有重要作用[23]。已有研究发现[24，11]，烟草赤星病危害期其叶际优势真菌为链格孢属，优势细菌有泛菌属和假单胞菌属。本研究采用Illumina 高通量测序技术对施用苯醚甲环唑前后感赤星病烟叶和健康烟叶叶际真菌与细菌群落结构和多样性进行分析，发现施药前后2 类烟叶的叶际优势真菌菌门均为子囊菌门，但感病烟叶子囊菌门相对丰度高于健康烟叶，其次优势菌门为担子菌门；优势细菌菌门为变形菌门，其次为厚壁菌门。在真菌属水平上，感赤星病烟叶和健康烟叶施药前后的菌属有链格孢属、Boeremia、枝孢霉属、Symmetrospora、亚隔孢壳属、附球菌属，其中链格孢属为优势菌属；在细菌属水平上，施药前后感赤星病烟叶与健康烟叶的主要菌属为泛菌属、假单胞菌属、鞘脂单胞菌属、马赛菌属，其中泛菌属为优势菌属。以上研究结果与向立刚等[24]、刘亭亭等[11]发现的感赤星病烟叶的优势真菌菌群结果一致。此外，前人[18]研究发现，烟草亚隔孢叶斑病危害期其叶际优势真菌有Boeremia、Meyerozyma、茎点霉属和链格孢属，优势细菌有假单胞菌属和泛菌属；烟叶霉烂病危害期其叶际优势真菌有米根霉、曲霉属、链格孢属、尾孢属和茎点霉属，优势细菌有假单胞菌属和泛菌属[25]。本研究结果与前人认为优势菌属均为其致病菌的研究结果类似，同时也说明烟草在不同病害发生时，其叶际微生物菌落结构均存在差异。

使用药剂会使叶际微生物群落结构发生改变。CHEN 等[14]研究发现，使用菌核净会降低烟叶叶际细菌鞘脂单胞菌属、黄色杆菌属和沙雷氏菌属的相对丰度；使用高效氯氰菊酯会降低植物叶际真菌生物量，增加细菌生物量[26]；高剂量阿维菌素改变了甘蓝叶际微生物的群落结构和组成，减少了叶际微生物生物量[27]。本研究发现，应用苯醚甲环唑对烟草叶际所有真菌和细菌菌属均产生了影响，施药后，感病烟叶叶际真菌链格孢属相对丰度在施药后5、15 d 降低，施药后10 d 增加，枝孢霉属在施药后相对丰度持续降低，而感病和健康烟叶叶际亚隔孢壳属相对丰度在施药后5、10 d 降低，施药后15 d 相对丰度增加，施药后其余菌属的相对丰度也呈现不规律的增减；感病烟叶叶际细菌泛菌属、马赛菌属、鞘脂单胞菌属相对丰度在施药后5、10 d 降低，施药后15 d 均上升，假单胞菌属的相对丰度在施药后一直保持上升状态。研究结果进一步验证，应用化学药剂会改变植物叶际微生物菌群结构。此外，苯醚甲环唑作为三唑类杀菌剂的典型代表，已在多种作物的病害防治上登记，防治对象包括小麦赤霉病、葡萄白粉病、甜菜褐斑病等。本研究发现，除主要病原菌外，苯醚甲环唑还会影响烟叶包括枝孢霉属、Symmetrospora、亚隔孢壳属等在内的多种病原真菌，同时也会影响包括假单胞菌属在内的多种非致病菌菌群结构的变化，结果进一步验证了苯醚甲环唑的广谱性与选择性。

植物健康与其叶际微生物菌群平衡紧密联系。本研究利用Shannon 指数和Chao1 指数分别表征微生物群落多样性和微生物群落丰富度，研究发现，感赤星病烟叶的叶际真菌群落多样性指数和丰富度指数均低于健康烟叶，结果与烟草赤星病[24]、亚格孢壳叶斑病[18]等真菌性病害对叶际微生物多样性与丰富度的影响研究结果一致，推测真菌性病害的发生均会降低叶际真菌的多样性。与施药前相比，施用苯醚甲环唑后，感病与健康烟叶叶际真菌群落的多样性指数和丰富度指数均发生了改变，感病烟叶在施药5 d时多样性和丰富度指数均升高，施药10 d时，感病烟叶多样性指数降低，丰富度指数升高，施药15 d 时，感病烟叶多样性指数升高，丰富度指数降低；健康烟叶在施药5、10 d 时多样性指数和丰富度指数均升高，施药15 d 时多样性指数降低，丰富度指数升高。说明药剂处理改变了叶际微生物群落多样性与丰富度，本研究结果与刘天波等[28]、黄阔等[29]发现施用拮抗菌群、微生物制剂会改变感野火病烟叶叶际微生物群落结构的结果类似。

叶际微生物菌群对碳源代谢活性的强弱能反映其代谢功能的强弱。本研究利用Biolog-ECO 技术分析了施药前后感赤星病烟叶与健康烟叶对常见31 种碳源的利用差异，结果发现，施药前感病烟叶对个别碳源代谢程度较低，如D，L-α-甘油、α-丁酮酸、L-苏氨酸，α-环式糊精；健康烟叶叶际微生物对除α-丁酮酸和2-羟基苯甲酸碳源外的供试碳源代谢活性均较强，推测感赤星病烟叶叶际微生物不喜好偏酸性的碳源。施用苯醚甲环唑后，感病与健康烟叶叶际微生物对供试碳源的利用均较弱，随时间延长，对碳源的代谢逐渐升高，表明苯醚甲环唑能快速降低感赤星病烟叶与健康烟叶叶际微生物的代谢活性，很大程度上改善了烟叶叶际微环境。但随着施药时间的增加，叶际微生物代谢活性缓慢增强，表明苯醚甲环唑在烟叶上的持效期有限。在赤星病的防控上，可以结合药剂的持效期增加施药次数，以持续发挥药剂的叶际微生态调控效果。