L-赖氨酸与谷氨酰胺转氨酶联合处理对低盐鸡肉糜凝胶保水及质构品质的影响

王 昱，王家乐，袁晶晶，李 可，栗俊广，赵慧娟，白艳红,*

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；2.河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450001；3.食品生产与安全河南省协同创新中心，河南 郑州 450001；4.河南链多多供应链管理有限公司，河南 鹤壁 456750）

凝胶类肉制品（包括糜类制品、乳化型制品、碎肉制品等），因其具有食用方便，口感鲜美，营养丰富等优点，深受消费者的喜爱，成为我国肉制品发展的主要趋势[1-2]。在凝胶类肉制品的生产加工中，需要较高含量（2%～3%）的食盐（NaCl）萃取肌原纤维蛋白，使其在加热过程中能互相交联、聚集，形成黏弹性好、结构稳固的三维凝胶网络，从而提高产品的保水性（water holding capacity，WHC）和质构特性[3-4]。据报道，目前我国人均食盐摄入量约为10 g/d，远高于世界卫生组织和《中国居民膳食指南（2022）》的推荐摄入量（5 g/d）[5-6]。钠盐的过量摄入，会导致血压升高，进而增加心血管疾病的发生风险。肉制品约贡献每日食盐总摄入量的16%～25%[7]，因此，低盐肉制品的开发是促进健康饮食的重要途径。由于NaCl发挥众多的功能作用，直接降低凝胶类肉制品中的NaCl含量，会使产品出现质量劣变，如WHC降低、质构松散、风味丧失等[8]。如何有效避免减盐带来肉制品品质下降，是肉品研究领域需要解决的一个难题。

谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase，TGase）是一种小分子单体蛋白质，能催化肉蛋白发生ɛ-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸共价交联反应，起到促进肉蛋白凝胶形成的作用，进而对肉制品的乳化稳定性、质地、流变学特性等产生积极影响，在肉制品中应用广泛[9-12]。但是，TGase对肉制品WHC结果并不一致。如Cando等[11]报道，TGase能提高肉糜制品的WHC，而Lesiow等[12]发现，TGase增加了猪肉糜凝胶的水分流失。另外，在低盐条件下，肌原纤维蛋白的结构较紧凑，难以暴露足够数量的谷氨酰胺和赖氨酸残基作为TGase反应底物，从而不利于TGase催化交联反应的进行[13]。因此，为更好利用TGase改善低盐肉制品品质，有必要将TGase与其他技术手段进行联合。

L-赖氨酸作为一种碱性氨基酸（等电点＞7.0），可作为食品增香剂、发色剂及营养强化剂用于食品加工，不会引入有害物质，因此是一种绿色的改性策略。GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》中规定，L-赖氨酸可作为食品用天然香精香料，且未作限量要求。近年来，L-赖氨酸在肉制品加工中的应用日益受到研究人员的关注。研究显示，L-赖氨酸能提高肉体系pH值，改变肉蛋白构象，提高肉蛋白分子柔性，从而改善肉蛋白的溶解性、乳化性、凝胶性等加工特性，提升肉制品的功能特性[14-16]。由于L-赖氨酸引起的蛋白质分子的解折叠会促进蛋白质活性基团的暴露[17]，因此，L-赖氨酸具有增强TGase与肉蛋白之间交联反应的潜力。然而，L-赖氨酸与TGase联合处理对低盐凝胶类肉制品品质的影响，还鲜见报道。

本研究以低盐（含质量分数1% NaCl）鸡肉糜（lowsalt chicken meat batter，LCMB）为对象，考察不同质量分数（0.25%、0.5%、0.75%、1%）L-赖氨酸结合TGase（0.5%质量分数）处理对LCMB凝胶WHC、质构、微观结构、蛋白质构象的影响，阐明L-赖氨酸和TGase协同处理对LCMB凝胶品质的影响规律及机制，旨在为高品质低盐凝胶肉制品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜鸡胸肉购于郑州大张超市，去除鸡胸肉表面的脂肪及筋膜，然后切成小块，用绞肉机绞碎，进行真空包装并贮存于－20 ℃。

NaCl（食品级）河南明瑞食品添加剂有限公司；L-赖氨酸（99.5%，食品级）上海金源生物技术有限公司；TGase（100 U/g，食品级）北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HM740绞肉机 青岛汉尚电器有限公司；GM200斩拌机 德国Restch公司；CR-GIII高速冷冻离心机、Regulus 8100冷场发射扫描电镜 日本日立公司；TA-XT Plus质构仪 英国Stable Micro System公司；Lab-1-50冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；Renishaw/in Via激光显微共聚焦拉曼光谱仪 英国雷尼绍公司；NMI20低场核磁共振成像分析仪 苏州纽迈分析仪器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LCMB的制备

冷冻贮藏的鸡胸肉置于4 ℃环境中解冻过夜[18]；然后放入斩拌机，2 000 r/min斩拌60 s；随后加入食盐和1/2冰水，2 000 r/min斩拌60 s；根据不同配方组成（表1），各组依次加入相同质量分数TGase（占肉糜总质量0.5%）及不同质量分数L-赖氨酸（占肉糜总质量的0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%），2 000 r/min斩拌60 s；最后加入剩下的1/2冰水，2 000 r/min斩拌60 s，即得到LCMB。其中，L-赖氨酸及TGase质量分数的选取参考预实验结果及相关文献[12]确定。

表1 添加L-赖氨酸和TGase的LCMB配方Table 1 Formulation of low-salt chicken meat batter added with L-lysine and TGase %

1.3.2 LCMB热诱导凝胶的制备

称取1.3.1节制得的肉糜置于50 mL聚丙烯离心管中，每管肉糜质量约35 g。将肉糜在4 ℃条件下，500×g离心3 min，去除肉糜中的气泡，然后于80 ℃水浴锅中加热30 min，得到LCMB凝胶。将LCMB凝胶取出后快速放入冰中冷却10 min，随后转移至0～4 ℃冰箱，静置过夜，用于WHC、质构、水分流动性和分布、微观结构及蛋白质构象的测定。

1.3.3 WHC测定

参考Guo Xiuxia等[19]的方法，用滤纸吸收鸡肉糜凝胶表面水分，取约5 g凝胶样品（质量记为m1），用滤纸包裹置于50 mL离心管中，1 000×g、4 ℃离心5 min，记录离心后剩余样品质量m2。按照下式计算WHC：

1.3.4 质构特性测定

参考Wang Yu等[20]的方法，用平行刀片将鸡肉糜凝胶切成高度为2 cm、底面直径为2.5 cm的圆柱体，使用TA-XT Plus质构分析仪进行质构特性分析。测试参数设置为：P/36R探头；测试前速率2.0 mm/s；测试速率2.0 mm/s；测试后速率5.0 mm/s；压缩比50%；自动触发5.0 g；间隔时间5.0 s。

1.3.5 水分特性测定

参考Zhang Daojiu等[21]的方法，通过NMI20低场核磁共振成像分析仪分析肉糜凝胶内部水分分布特性。将约2 g肉糜凝胶样品放入直径15 mm核磁管中，使用CPMG序列进行测试。测试参数如下：测试温度32 ℃，质子共振频率22 MHz，90°脉冲和180°脉冲间隔时间200 μs，重复扫描32 次，两次扫描之间的间隔时间5.0 s，回波数18 000。得到指数衰减图形，通过SIRT算法反演拟合得到T2谱图。

1.3.6 微观结构测定

参考潘杰等[22]的方法，将肉糜凝胶切成2 mm×2 mm×2 mm的立方体，用体积分数4%甲醛和2.5%戊二醛混合溶液（1∶1，V/V）固定2 h；用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.2）漂洗3 次，每次15 min；用乙醇溶液（30%～100%）和丙酮（100%）溶液脱水，每次各15 min，冷风除去易挥发的有机溶剂；真空冷冻干燥15 h，喷金，用Regulus 8100冷场发射扫描电镜观察凝胶的微观结构，加速电压3 kV，放大倍数2 000。

1.3.7 蛋白质构象测定

参考康壮丽等[23]的方法，取适量鸡肉糜凝胶样品，置于载玻片上，通过激光显微共聚焦拉曼光谱仪检测蛋白质的构象变化。使用以下参数进行测试：激光波长785 nm，焦距镜头50 倍，采集次数10 次，曝光时间10 s，光谱波长范围 400～3 500 cm－1，分辨率2 cm－1。使用Labspec version 5.0软件对光谱进行基线校正和平滑处理，根据苯丙氨酸1 003 cm－1的谱带进行光谱的归一化处理（此峰强度不随蛋白质结构变化而变化）[24]。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB凝胶WHC的影响

WHC大小代表蛋白质网络捕获水的能力高低，直接影响肉和肉制品的质量好坏。如图1所示，对照组（C0）的WHC仅为75%，表明低盐条件不利于鸡肉糜凝胶对水分的保持，这是因为盐溶性肌原纤维蛋白的溶出较少，难以在加热过程中产生充分的交联反应，形成的凝胶结构不稳定，进而增加了水分的流失[20]。TGase对LCMB凝胶的WHC无显著影响（P＞0.05），这与Shang Yongbiao等[25]的结果一致。TGase对肉制品WHC的影响存在矛盾的结果，其增加/降低猪肉糜凝胶WHC的结果均有报道[11-12]。这些不一致的结果可能与肉的来源、TGase添加量及其作用条件（反应温度和时间）、肉糜体系其他存在的成分等有关[12]。在添加TGase的情况下，随着L-赖氨酸添加量由0%增至1%，LCMB凝胶的WHC从75%增至88%。与C0组相比，T3～T5组的WHC显著增加（P＜0.05），且T3～T5组之间的WHC无显著差异（P＞0.05）。L-赖氨酸能增强肌原纤维蛋白的溶解，促进肉蛋白结构的展开、变性和聚集，诱导形成致密的凝胶网络结构，从而提高肉制品的WHC[26-27]。此外，L-赖氨酸还可提高肉体系的pH值，增强蛋白质之间的静电斥力，提高蛋白质凝胶对水分的束缚能力[15]。Zhu Xiaoxu等[27]在探究L-赖氨酸对乳化鸡肉肠WHC的影响时也发现了类似的现象。综上，本实验结果表明，0.5% TGase结合L-赖氨酸（质量分数≥0.5%）处理能有效改善LCMB凝胶的WHC，具有改善低盐肉制品持水特性的潜力。

图1 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB凝胶WHC的影响Fig.1 Effect of combined treatment of L-lysine nad TGase on the WHC of LCMB gels

2.2 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB凝胶质构特性的影响

由表2可知，与C0组相比，T1组的硬度显著增加（P＜0.05）。TGase能使肉蛋白形成ɛ-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸共价交联，增强蛋白质分子间作用力，提高凝胶结构的稳定性，从而促进肉制品硬度的提高[28]。另外，TGase处理可促进肉蛋白α-螺旋结构向β-折叠和β-转角结构转变，利于良好凝胶结构的形成，从而改善肉制品的质构特性[23]。在TGase存在的情况下，LCMB凝胶的硬度、弹性、内聚性和咀嚼性随着L-赖氨酸含量的增加呈现升高趋势，当L-赖氨酸添加量为1%时，LCMB的各项质构参数（硬度除外）均达到最高值。可能的原因有：一方面，L-赖氨酸能促进肉蛋白分子的展开和活性基团的暴露[29]，这可能导致TGase可反应底物数量增加，进而增强TGase对肉蛋白的交联作用；另一方面，L-赖氨酸能改变肉蛋白的构象，促进形成黏弹性好的凝胶三维网络结构，利于质构特性的提高[18]。此外，有研究表明，肉制品质构（如硬度、咀嚼性等）与蛋白质含量有关[30]。由于T1～T5组配方中的水分添加量均低于C0组，可起到“浓缩”蛋白质的作用，这也可能是T1～T5组质构特性得到改善的原因。本实验结果与Guo Xiuxia等[19]的研究不一致，他们发现L-赖氨酸能抑制肌球蛋白的热聚集，不利于三维凝胶网络结构的形成，进而导致重组火腿质构的下降。这些不一致的现象可能与赖氨酸添加量、肉制品类型、肉体系的pH值和离子强度等因素有关。

表2 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB凝胶质构特性的影响Table 2 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on textural properties of LCMB gels

2.3 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB凝胶水分特性的影响

由图2可知，各组LCMB凝胶均呈现4 个T2弛豫时间峰：0.1～1 ms为强结合水（T2a）；1～10 ms为弱结合水（T2b）；10～100 ms为不易流动水（T21）；100～10 000 ms为自由水（T22）[31]。肉糜凝胶持水性的变化能通过不同状态水分的分布比例反映[32]。LCMB凝胶中不同状态水分相对含量的变化如表3所示，其中，P2a、P2b、P21、P22分别代表强结合水、弱结合水、不易流动水和自由水的相对含量。由表3可知，TGase对LCMB凝胶P2a、P2b、P21、P22无显著影响（P＞0.05）。与C0组相比，T2～T5组的P2a和P2b无显著变化（P＞0.05），P21显著增加（P＜0.05），而P22显著降低（P＜0.05），表明L-赖氨酸协同TGase处理能促进LCMB凝胶中自由水向不易流动水转化。有研究指出，P21的增加和P22的降低能提高肉糜凝胶WHC[33]，这与WHC结果一致。可能是因为L-赖氨酸能提高肉体系的pH值，增加肉蛋白分子间的静电斥力，进而增强蛋白质-水相互作用[15]。

图2 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB凝胶水分弛豫时间的影响Fig.2 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on relaxation time of water protons in LCMB gels

表3 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB凝胶不同状态水分相对含量的影响Table 3 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on relative contents of water in different states in LCMB gels %

2.4 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB凝胶微观结构的影响

肉制品的WHC和质构特性与其微观结构有密切联系[18]。LCMB凝胶的微观结构通过扫描电镜观察，结果如图3所示。不同处理组的LCMB凝胶微观结构差异明显。C0组凝胶疏松，含有大量形状各异的孔隙。肉糜经过加热后，蛋白质发生变性使吸附的水分析出，转变为自由水，在流失的过程中形成大量的“水通道”[34]。因此，这些孔隙应该是水分流失形成的“水通道”。T1组凝胶网络的交联程度明显提高，且孔隙的大小也变小。TGase能催化肉蛋白中的赖氨酸和谷氨酸交联形成共价键，促进形成密实的肉糜凝胶结构[20]。在添加TGase的基础上，L-赖氨酸能进一步减小LCMB凝胶中的孔隙数量和大小，并提高了凝胶网络的均匀性、有序性和致密性，这些变化可以通过T2～T4组扫描电镜图反映。L-赖氨酸能促进肉蛋白活性基团的暴露，增强蛋白质分子间的相互交联，从而改善了肉糜凝胶的微观结构[15]。有研究表明，密实的蛋白质凝胶网络结构有利于提高肉制品的WHC和质构[35]。因此，L-赖氨酸协同TGase能通过减少LCMB凝胶中“水通道”的产生，促进形成致密、均匀、有序的凝胶网络结构，从而提高了凝胶的WHC（图1）和质构特性（表2）。

图3 LCMB凝胶的扫描电镜图（×2 000）Fig.3 Scanning electron microscopic images of LCMB gels (× 2 000)

2.5 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB蛋白质构象的影响

为解析L-赖氨酸协同TGase对LCMB凝胶特性影响的分子机制，通过拉曼光谱分析了肉糜蛋白质构象的变化。如图4所示，760、830 cm－1和850 cm－1的双峰以及2 930 cm－1处的拉曼谱峰分别能反映色氨酸残基、酪氨酸残基以及脂肪族氨基酸残基的微环境变化，进而提供蛋白质三级结构的变化信息[33,36-37]。L-赖氨酸及TGase对上述特征拉曼谱峰的归一化强度影响见表4，与C0组相比，T1组的760 cm－1强度轻微增加（P＞0.05）。在添加TGase的情况下，随着L-赖氨酸含量的增加，760 cm－1强度呈现下降的趋势，表明L-赖氨酸能促进肉糜蛋白质色氨酸残基的暴露[33]，使肉蛋白的微环境更加亲水，进而有利于凝胶网络对水分的截留[38]，最终提高肉制品的WHC。I850/I830比值一般在0.3～2.5范围内。当I850/I830比值较大（＞0.9）时，表明酪氨酸残基上的羟基主要暴露于极性水环境。I850/I830比值越高，酚羟基暴露越多，与水分子形成氢键；I850/I830比值越低，酚羟基埋藏越多，与相邻的蛋白质极性基团形成氢键[36]。各处理组中的I850/I830均大于0.9，表明肉糜蛋白质中酪氨酸残基的酚羟基暴露在极性水环境中。与C0组相比，T2～T5组I850/I830有增加的趋势，说明L-赖氨酸协同TGase能促进酪氨酸残基的暴露，与水分子形成氢键。2 930 cm－1处的拉曼谱峰，代表脂肪族氨基酸残基CH的伸缩振动。与C0组相比，T2～T5组的I2930/I1003呈现升高的趋势，表明L-赖氨酸及TGase联合处理能促进肉蛋白结构的展开，引起脂肪族氨基酸残基的暴露[37]。拉曼光谱的结果表明，L-赖氨酸协同TGase能促进肉蛋白活性基团的暴露，诱导产生更多的分子间相互作用，从而有利于提高LCMB凝胶的品质。

图4 L-赖氨酸协同TGase处理下LCMB凝胶的拉曼光谱（700～2 000 cm－1）Fig.4 Raman spectra of LCMB gels added with L-lysine and TGase (700-2 000 cm-1)

表4 L-赖氨酸协同TGase处理对LCMB凝胶归一化拉曼强度的影响Table 4 Effect of combined treatment of L-lysine and TGase on normalized Raman intensity of LCMB gels

3 结论

L-赖氨酸协同TGase处理可促进LCMB凝胶中自由水向不易流动水转化，减少LCMB凝胶中“水通道”的产生，诱导形成致密、均匀、有序的凝胶网络结构，促进肉糜蛋白质中色氨酸残基、酪氨酸残基以及脂肪族氨基酸残基的暴露，增强蛋白质分子间相互作用，从而改善LCMB凝胶的WHC和质构特性。因此，L-赖氨酸与TGase联合处理是一种有效改善低盐肉糜凝胶特性的方式，这为高品质低盐凝胶类肉制品的开发提供了新的解决方案。