一个基于当地特色的综合化学实验设计*

易冰阳，陈子川，谭巧巧，王 丽，徐建军

(湖北工程学院化学与材料科学学院，湖北 孝感 432000)

湖北省孝感安陆市拥有我国目前现存的两大自然状态古银杏群落之一，是著名的“银杏之乡”。当地政府依托银杏种植进行了旅游产业的发展，但对于银杏自身价值挖掘不多。银杏不仅果实具有很好的药用价值，银杏叶也具有通脉舒络、益心敛肺的功效。近年来国内外学者对银杏叶提取物的化学成分、药理功效进行了广泛研究[1-2]。银杏叶提取物中含有黄酮、萜内酯、多糖、聚异戊烯醇等多种复杂成分[3]。总黄酮是黄酮类化合物的总称，其不仅在银杏叶中含量高，还具有很强的药理活性[4-5]，可以止咳平喘、抗自由基和抗肿瘤的作用，还可以防治心脑缺血损伤、肝损伤及心律失常，同时还具有皮肤保健功能[6-7]。目前黄酮类化合物主要用于心脑血管类药物及部分营养品和化妆品的成分[8]。优化银杏叶中黄酮类化合物的提取工艺可以降低企业成本，有利于相关产业的发展。

笔者所在高校作为孝感市地方本科院校，目前正处在由传统的理论型人才培养模式向应用型人才培养模式进行改革的关键时期。应用型人才的培养模式改革中就包括了教学内容的改革，教学内容改革的关键之一就是要满足地方区域化经济发展的需要，要尽可能与地方经济特色相结合[9-11]。综合化学实验是一门将基础化学实验和仪器分析实验有机结合的实验课程，一般在高年级开设，其实验内容不仅要锻炼学生对所学专业知识和实验技能的综合应用能力，同时要与地方特色结合，培养学生解决地方经济发展中科学问题的能力。基于以上考虑，在我校开设银杏叶中黄酮的提取和结构鉴定实验不仅可以帮助学生掌握有机物提取流程和结构鉴定方法，了解提取工艺对提取效率的影响，还将为我们的学生以后服务地方经济打下基础。

1 文献查阅和实验设计阶段

实验的第一阶段为文献查阅和方案设计阶段。首先依据单因素实验方法对学生进行分组，每组3～4人。安排学生通过中国知网(CNKI)、RSC、Wiley、ACS和Elsevier等数据库查阅近五年相关文献5～10篇，了解银杏叶中总黄酮的提取方法，提取率影响因素及结构表征分析。然后小组成员对题目所涉及到的知识、原理、方法和仪器等进行讨论，确定好实验方案并提交老师审核。让学生利用课余时间去查阅文献，并引导学生主动设计实验方案，使学生感受到综合化学实验与基础实验的不同之处。

2 银杏叶中总黄酮的提取

实验的第二阶段为银杏叶中总黄酮的提取。文献中总黄酮的提取方法通常有：回流提取法、超声提取法和微波提取法等。由于超声提取法和微波提取法很难开展多组实验，因此随机抽取两组学生分别通过超声提取法和微波提取法进行银杏叶中总黄酮的提取，其他组学生均通过乙醇回流法提取银杏叶中的总黄酮。总黄酮含量均采取硝酸铝显色法进行测定[12]。

2.1 标准曲线的绘制

图1 芦丁标准曲线Fig.1 The standard curve of rutin

准确称取恒重过的无水芦丁0.030 0 g，用50%的乙醇溶液配制成100.00 mL溶液备用。用移液管分别移取5.00、10.00、15.00、20.00和25.00 mL的芦丁溶液于50 mL容量瓶中，依次加入亚硝酸钠、硝酸铝和氢氧化钠溶液显色后定容，测定其在510 nm的吸光度。最后以芦丁标准溶液浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线(如图1所示)，要求标准曲线线性拟合度达到0.999以上。

2.2 单因素实验分组及结果分析

单因素实验是指在实验中，保持其他因素不变，只观察一种因素的变化来确定整体实验中该因素的具体作用及影响。乙醇回流提取法中影响总黄酮提取效率的因素通常包括提取时间、提取温度、液料比、乙醇浓度以及提取次数等，因此在实验过程中可以将学生分为5组，每组以其中一个因素为对象进行试验，计算不同条件下银杏叶中总黄酮的提取效率，通过对比各小组实验结果可以初步得出银杏叶中总黄酮提取的最佳实验条件。为保证实验结果的可靠性，一般要求学生进行2～3次提取实验，同时在实验过程中找出自己的不足进行改进。由于每一组实验为一个单因素，因此在实验过程中，还要求学生进行团队合作。

图2是学生单因素实验的结果。

图2 提取时间(a)、提取温度(b)、乙醇体积分数(c)、液料比(d)对总黄酮提取量的影响Fig.2 The effect of extraction time (a)，extraction temperature (b)，ethanol content (c)and liquid-solid ration (d)on the extraction efficiency of ginkgo biloba flavonoids

由图2可知，延长提取时间，总黄酮提取率出现先增加，后几乎不变的趋势，因此在实际提取过程，需综合考虑提取率和提取成本的关系，以本结果为例，可选择提取率最高的4 h作为实验条件，也可选择提取率较低的2 h作为实验条件，因为此时虽然提取率较低，但提取的时间成本和能耗成本更低。从图2b可以看出，随着提取温度的增加，总黄酮提取量不断增加，这是由于提取温度越高，分子运动速度越快，黄酮类化合物从银杏叶转移至乙醇中的速率也会加快，使得提取量不断增大。但温度超过乙醇沸点后，乙醇挥发严重，能耗成本也在不断增加，因此本例中可选择70 ℃作为最佳反应条件。图2c为提取所用乙醇体积分数对提取效率的影响，由图2c可知，所使用乙醇体积分数越大，总黄酮的提取效果越好。银杏叶提取物主要以有机物为主，乙醇浓度越大，提取效果越好，符合有机萃取法的科学原理。液料比对总黄酮的提取效率也有着明显影响，随着液料比的增大，总黄酮提取率出现了先增加，后减小的趋势(图2d)。原因可能是随着液料比的增加，银杏叶粉末可以与溶剂进行充分的接触，黄酮类化合物能更好的进入溶剂，银杏叶提取物的总黄酮得率随之增大。当液料比过高时，会有更多的杂质溶出，或者部分黄酮类化合物与溶剂长时间接触会导致结构破坏，使得总黄酮得率降低。

通过单因素实验结果，让学生充分意识到实验工艺对实验结果的影响，同时明白在实际生产中要综合考虑生产成本和产品转化效率。

3 总黄酮结构初步分析

本实验的第3阶段为样品的表征阶段。目前，鉴定黄酮类化合物结构的方法主要有显色反应、紫外-可见分光光度法、红外光谱法、核磁共振和液相色谱-质谱联用法等[13-15]。在此阶段，教师可以提前布置任务，让学生自主学习各仪器的基本原理，了解不同仪器的功能和使用方法。实验过程中，可由教师或者有经验的研究生助教带领学生完成仪器操作过程。在这一过程，学生对接触到的大型仪器设备兴趣非常浓厚，因此大多数学生都可以积极主动的完成仪器设备的自主学习和实际操作部分。实验完成后，教师要进一步引导学生在小组内展开讨论，通过文献资料的查阅对实验现象和实验结果进行科学合理的分析，使学生在实践过程中学会透过实验现象去探索实验本质，丰富学生的知识储备。最后，学生需按组提交测试结果和相关实验报告。

3.1 显色反应

黄酮类化合物可以发生多种显色反应，例如：多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物可以与盐酸-镁粉(或锌粉)反应显橙红～紫红色，少数显紫蓝色，儿茶素、查尔酮和橙酮无此显色反应；二氢黄酮类化合物与NaBH4反应显红色或紫色，其它黄酮类化合物均不显色，因此NaBH4可专属鉴别二氢黄酮类化合物；二氢黄酮、二氢黄酮醇类与醋酸镁的甲醇溶液，加热可显天蓝色荧光，而黄酮、黄酮醇及异黄酮类等则显黄色、橙黄色或褐色。此外还可以通过不同类型的黄酮类化合物在日光下纸斑反应颜色的变化来进行结构鉴定，其中黄酮醇类化合物会先变黄色，通空气后变为棕色，二氢黄酮类化合物则呈现出黄色或橙色，氨蒸气处理后在空气中颜色褪去[13]。银杏叶提取液颜色反应结果如表1所示。

表1 银杏叶提取物与不同试剂的颜色反应结果Table 1 Color reaction of ginkgo biloba extract with different reagents

从表1中可以初步判断银杏叶中含有二氢黄酮类化合物。

3.2 紫外-可见光谱分析

大多数黄酮类化合物结构中存在苯甲酰基和肉桂酰基的交叉共轭体系，其中肉桂酰基产生的吸收带(带I)对应的最大吸收波长在310～400 nm内，苯甲酰基产生的吸收带(带II)对应的最大吸收波长在245～285 nm内。但是不同类型的黄酮化合物由于其分子中羟基数目和位置不同，或者共轭体系存在形式的不同，其紫外-可见吸收光谱会存在一定差异。其中黄酮或黄酮醇化合物带I和带II吸收峰峰强相似，均为主峰；查耳酮及橙酮类化合物的带II吸收峰则较带I吸收峰略弱，即带I为主峰，带II为次强峰；而异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物带II吸收峰很强，带I很弱，常表现为在主峰的长波方向处有一肩峰[13]。从图7可以看出，芦丁分别在359 nm和257 nm处出现了由肉桂酰生色团和苯甲酰生色团产生的吸收峰，吸收峰强度相似，属于黄酮醇类。银杏叶提取物的紫外吸收光谱较芦丁标准物则有明显不同，参照文献可知，银杏叶带I为肩峰，峰强度较弱，因此可初步判断银杏叶提取物中为二氢黄酮或二氢黄酮醇类。

图3 芦丁及银杏叶提取物的紫外-可见光谱图Fig.3 The UV-Vis spectra of rutin and ginkgo biloba extract

3.3 红外光谱分析

采用溴化钾压片法测试芦丁标准品和银杏叶提取物的红外光谱。由图4可知，芦丁标准样品与银杏叶提取物在约3 400 cm-1处存在羟基伸缩振动峰，位置与强度略有不同，其中芦丁标准品的羟基伸缩振动峰出现在3 432 cm-1处，峰强较大，而银杏叶提取物中羟基伸缩振动峰出现在3 400 cm-1处，峰强减小，并且银杏叶提取物的峰形相比芦丁标准品要宽。一般地，当黄酮类化合物上的羟基数量较多时会导致峰形变宽，因此产生这种细微差异的原因可能是由于银杏叶提取物中羟基数量较芦丁标准品更多所致[16]。3 009 cm-1为苯环C-H的弯曲振动吸收峰，在1 617 cm-1处存在银杏叶提取物中羰基的伸缩振动吸收峰，在1 394 cm-1处存在银杏叶提取物分子中苯环碳骨架的伸缩振动吸收峰，此外银杏叶提取物在1 076 cm-1和1 039 cm-1处存在明显的伸缩振动吸收峰，应该归属为醚类物质中的C-O键的伸缩振动。结合显色反应和紫外-可见分光光度法的结果，推测银杏叶提取物主要成分可能为二氢黄酮类化合物中的水飞蓟素。

图4 芦丁和银杏叶提取物的红外光谱图Fig.4 The FT-IR spectra of rutin and ginkgo biloba extract

利用显色反应、紫外-可见分光光度法及红外光谱法初步鉴定银杏叶提取物的结构后，教师可进一步引导有兴趣的同学进行质谱和高效液相色谱检测，对银杏叶提取物中的具体成分做更准确的分析。

4 结 语

将银杏叶中总黄酮的提取和结构鉴定引入本科教学中，实验所用原料具有地方特色且廉价易得，实验原理有科学依据，实验过程丰富，着重锻炼学生对分析化学中定量分析标准曲线的制作、有机化学实验中回流法、有机波谱分析以及现代仪器测试方法的相关能力，能显著提升学生的综合实验水平，符合综合化学实验的大纲要求，可以作为一个具有地方特色的实验课题进入综合化学实验课程。