基于内质网应激探讨越婢加术汤对糖尿病肾病患者的治疗机制

黄赛娇， 林意， 卢艳， 朱叶

（琼海市中医院，海南琼海 571400）

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）为糖尿病并发症之一，近年来DKD 进展为慢性肾衰的比率逐年攀升，是造成终末期肾衰竭的主因[1]。据报道[2]，我国DKD 在终末期肾病中约占15%。DKD 发病机制复杂，研究[3]发现内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与DKD 发病关系密切，高血糖可诱发机体ERS，而ERS 及其介导的细胞凋亡在DKD 发病过程中起重要作用。中药在DKD 早期防治中有独特优势，可使DKD 的病情进展得到有效延缓。越婢加术汤出自医圣张仲景的《金匮要略》，由石膏、麻黄、白术、生姜、大枣等组成，功在疏风清热、宣肺利水[4]。现代医学研究[5-6]表明：（1）越婢加术汤可改善阿霉素肾病大鼠肾功能以及减轻其肾脏病理损害；（2）越婢加术汤对于DKD 患者肾性水肿有一定改善作用，有利于病情好转。但越婢加术汤是否能通过对DKD患者的ERS 产生影响而发挥治疗作用，目前尚不清楚。基于此，本研究拟从ERS 角度，探讨越婢加术汤对DKD 患者的治疗效果及机制。现将研究结果报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组选取2020年8月～2022年8 月海南省琼海市中医院收治的114 例脾肾阳虚型DKD 患者为研究对象，按照随机数字表法将患者随机分为观察组和对照组，每组各57 例。本研究符合医学伦理学要求并通过海南省琼海市中医院医学伦理委员会的审核批准。

1.2 诊断标准

1.2.1 西医诊断标准 参照《中国成人糖尿病肾脏病临床诊断专家共识》[7]中的DKD 诊断标准：①糖尿病病史明确；②尿白蛋白/肌酐之比（albumin/creatinine ratio，ACR）≥30 mg/g 或尿白蛋白排泄率（albumin excretion rate，AER）≥20 μg/min。

1.2.2 中医辨证标准 参照张伯礼等主编、人民卫生出版社出版的《中医内科学》[8]制定DKD 脾肾阳虚型的中医辨证标准：①主症：肢体浮肿，小便不利，身倦乏力；②次症：食欲降低，腰膝酸软；③舌脉：舌淡胖，苔薄白，脉沉细。

1. 3 纳入标准①符合上述DKD 的西医诊断标准，且DKD 分期处于Ⅳ期；②中医证型为脾肾阳虚型；③年龄30～75 岁，性别不限；④智力正常，意识清晰，能配合相关治疗和指标检测；⑤入组前未行DKD 相关治疗；⑥病历资料完整；⑦自愿参加本研究并签署知情同意书的患者。

1. 4 排除标准①有原发性肾脏疾病的患者；②1 型糖尿病患者；③有肾毒性药物服用史的患者；④合并有严重心、脑、肝、肺功能障碍的患者；⑤合并有精神系统疾病、凝血功能障碍、恶性肿瘤、药源性蛋白尿的患者；⑥孕妇及哺乳期女性；⑦已知对受试药物过敏的患者；⑧正在接受其他临床研究的患者。

1.5 剔除标准①不符合纳入标准而被误纳入的患者；②依从性差，不能坚持治疗的患者；③治疗过程中发生严重不良反应，研究者认为不适合继续参加临床试验的患者；④试验期间自行要求退出的患者。

1.6 治疗方法

1. 6. 1 对照组 给予常规西医治疗。①基础治疗：根据《中国2型糖尿病防治指南（2020年版）》[9]进行基础治疗，如控制血脂、降血压、健康宣教、饮食指导等，并根据病情给予降糖药或者注射胰岛素等。②还原型谷胱甘肽注射液（福安药业集团湖北人民制药有限公司生产，批准文号：国药准字H20 183086；规格：0.6 g/瓶）1.8 g，用0.9%氯化钠注射液（浙江康乐药业股份有限公司生产，批准文号：国药准字H33 020655；规格：250 mL∶2.25 g）250 mL 稀释后静脉滴注，每天1 次。疗程为3个月。

1.6.2 观察组 在对照组的基础上联合越婢加术汤治疗。方药组成：麻黄12 g、石膏30 g、生姜5 片、甘草6 g、白术15 g、大枣6枚。上述中药均由海南省琼海市中医院中药房提供。每天1剂，常规煎取药汁300 mL，分早、中、晚3次温服。疗程为3个月。

1.7 观察指标及疗效评价标准

1.7.1 中医证候评分 参照文献[10]制定中医证候评分量表，根据症状严重程度分为无、轻度、中度、重度4 级，主症分别计为0、2、4、6 分，次症分别计为0、1、2、3 分；分值越高，表示症状越严重。观察2组患者治疗前后主症积分和次症积分的变化情况。

1.7.2 临床疗效评价 参照文献[10]制定疗效评价标准，分显效、有效、无效3级。①显效：临床症状和AER 均明显改善，AER 降幅≥50%，证候总积分（主症积分+次症积分）降幅≥75%；②有效：临床症状和AER 均有所改善，10%≤AER 降幅＜50%，30% ≤证候总积分降幅＜75%；③无效：临床症状和AER 均未见改善，AER 降幅＜10%，证候总积分降幅＜30%。总有效率=（显效例数+有效例数）/总病例数×100%。

1.7.3 血糖指标和肾功能指标检测 分别于治疗前后，抽取患者空腹外周静脉血3 mL，以3 000 r/min离心处理15 min（离心半径为10 cm），取上层血清。采用日立7600-020型全自动生化分析仪（上海企晟医疗器械有限公司）测定尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、24 h尿蛋白、肌酐（serum creatinine，SCr）、空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）水平。由医院检验科负责检测。观察2组患者治疗前后各项血糖指标和肾功能指标的变化情况。

1.7.4 内质网应激相关指标检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法测定外周血中葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatory protein 78，GRP78）、蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）mRNA表达水平。具体操作步骤如下：将血液标本以1 000 r/min离心处理5 min（离心半径为10 cm），行血浆分离，低温保存。利用超快血液总RNA提取试剂盒（Trizol法）提取血浆中的总RNA，利用NanoDrop1000超微量分光光度计（上海实维实验仪器技术有限公司）定量总RNA 质量，利用cDNA 第一链合成试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）将总RNA 逆转录为cDNA，而后在Thermofisher 7500 Real-Time定量PCR仪（上海恒斐生物科技有限公司，试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司）上行PCR反应（反应体系：cDNA 1.0 μL、PCR mix 10.0 μL、上下游引物各0.4 μL、ddH2O 8.2 μL；反应条件：93 ℃条件下变性60 s，55 ℃条件下退火60 s，72 ℃条件下延伸60 s，40 个循环）。结果以2-△△Ct法表示。引物序列如下：内参GAPDH：正向5’-CACA GTCCATGCCATCACTGC-3’与反向5’-GGTCTAC ATGGCAACTGTGAG-3’；GRP78：正向5’-CCGT GCTGCGCTTCTTCTTCTGTG-3’与反向5’-GCGGG ACTTGAGTTCGAGGGATGG-3’；PERK：正向5’-AGGCGTGCAAATCTGTCTCG-3’与反向5’-TGCA TTTGGATAGCTGGTTTAGT-3’；CHOP：正向5’-CACAAGCACCTCCCAAAGC-3’与反向5’-CTCTC ATTCTCCTGCTCCTTCTC-3’。观察2 组患者治疗前后GRP78、PERK、CHOP mRNA 表达水平的变化情况。

1.7.5 安全性评估 观察2 组患者治疗过程中不良反应发生情况，评价2组治疗方案的安全性。

1.8 统计方法应用SPSS 24.0统计学软件进行数据的统计分析。计量资料（均符合正态分布和方差齐性要求）以均数±标准差（±s）表示，组内治疗前后比较采用配对设计t检验，组间比较采用两独立样本t检验；计数资料以率或构成比表示，组间比较采用χ2检验。均采用双侧检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组患者脱落情况及基线资料比较治疗过程中，2组患者均无脱落剔除病例，均能完成全部疗程的治疗。对照组57 例患者中，男31 例，女26 例；年龄30～75岁，平均年龄（57.50±3.48）岁；2型糖尿病（T2DM）病程（7.85±1.02）年，DKD病程（16.52±2.27）个月。观察组57例患者中，男33例，女24 例；年龄30～75 岁，平均年龄（58.23 ±3.67）岁；T2DM 病程（7.91±1.12）年，DKD 病程（17.05±2.19）个月。2 组患者的性别、年龄、病程等基线资料比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），表明2 组患者的基线特征基本一致，具有可比性。

2.2 2组患者治疗前后中医证候积分比较表1结果显示：治疗前，2组患者的主症积分和次症积分比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。治疗后，2组患者的主症积分和次症积分均较治疗前明显降低（P＜0.01），且观察组对主症积分和次症积分的降低幅度均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表1 2组脾肾阳虚型糖尿病肾病（DKD）患者治疗前后中医证候积分比较Table 1 Comparison of TCM syndrome scores between two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment （±s，分）

表1 2组脾肾阳虚型糖尿病肾病（DKD）患者治疗前后中医证候积分比较Table 1 Comparison of TCM syndrome scores between two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment （±s，分）

注：①P＜0.01，与治疗前比较；②P＜0.01，与对照组治疗后比较

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2.3 2组患者临床疗效比较表2结果显示：治疗3 个月后，观察组的总有效率为91.23%（52/57），对照组为70.18%（40/57），组间比较（χ2检验），观察组的临床疗效明显优于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。

表2 2组脾肾阳虚型糖尿病肾病（DKD）患者临床疗效比较Table 2 Comparison of clinical efficacy between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type [例（%）]

2.4 2组患者治疗前后血糖指标比较表3结果显示：治疗前，2 组患者的FPG、HbA1c 水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。治疗后，2组患者的FPG、HbA1c 水平均较治疗前明显降低（P＜0.05），且观察组对FPG、HbA1c 水平的降低幅度均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表3 2组脾肾阳虚型糖尿病肾病（DKD）患者治疗前后血糖指标比较Table 3 Comparison of blood glucose indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment（±s）

表3 2组脾肾阳虚型糖尿病肾病（DKD）患者治疗前后血糖指标比较Table 3 Comparison of blood glucose indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment（±s）

注：①P＜0.05，与治疗前比较；②P＜0.01，与对照组治疗后比较

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2.5 2组患者治疗前后肾功能指标比较表4结果显示：治疗前，2 组患者的SCr、24 h 尿蛋白、BUN 水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。治疗后，2 组患者的SCr、24 h 尿蛋白、BUN 水平均较治疗前明显降低（P＜0.01），且观察组对SCr、24 h尿蛋白、BUN水平的降低幅度均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

表4 2组脾肾阳虚型糖尿病肾病（DKD）患者治疗前后肾功能指标比较Table 4 Comparison of renal function indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment（±s）

表4 2组脾肾阳虚型糖尿病肾病（DKD）患者治疗前后肾功能指标比较Table 4 Comparison of renal function indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment（±s）

注：①P＜0.01，与治疗前比较；②P＜0.01，与对照组治疗后比较

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2.6 2 组患者治疗前后内质网应激相关指标比较表5 结果显示：治疗前，2 组患者的GRP78、PERK、CHOP mRNA 表达水平比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。治疗后，2组患者的GRP78、PERK、CHOP mRNA表达水平均较治疗前明显降低（P＜0.01），且观察组对GRP78、PERK、CHOP mRNA 表达水平的降低幅度均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表5 2组脾肾阳虚型糖尿病肾病（DKD）患者治疗前后内质网应激相关指标比较Table 5 Comparison of endoplasmic reticulum stress related indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment （±s，2-△△Ct）

表5 2组脾肾阳虚型糖尿病肾病（DKD）患者治疗前后内质网应激相关指标比较Table 5 Comparison of endoplasmic reticulum stress related indicators between the two groups of patients with diabetic kidney disease（DKD）of spleen-kidney yang deficiency type before and after treatment （±s，2-△△Ct）

注：①P＜0.01，与治疗前比较；②P＜0.05，与对照组治疗后比较

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2.7 安全性分析治疗期间，2 组患者均未发生严重不良反应，患者的血压、心电图、血常规、肝功能等均未见明显异常，具有较高的安全性。

3 讨论

糖尿病肾病（DKD）为糖尿病微血管并发症中的一种，临床表现为大量蛋白尿、水肿、肾功能降低等，是导致糖尿病患者死亡的重要原因。现代医学治疗DKD 的手段包括控制血糖、降血压、扩张肾脏入球小动脉、营养干预等，但总体疗效欠佳[11-12]，近年来临床中越来越多的学者选择联合应用中医药疗法治疗DKD，取得令人满意的疗效。

根据DKD 的临床表现，可将其归属于中医“消渴”“关格”“消渴肾病”等范畴，本虚标实为其基本病机特点。DKD 发展至Ⅳ期，患者往往是在气阴两虚证候的基础上出现了阳气虚衰，故以脾肾阳虚为其主要病机。脾主运化，肾主水，机体脾气虚弱，肾阳不足，水液代谢失调，湿浊之邪泛溢肌肤，而成水肿；津液精微不归正化，导致谷气下流、精微外泄，而成大量蛋白尿。《圣济总录》云：“消渴病日久，肾气受损，肾主水，肾气虚衰，则气化不利，开阖失司，水液积聚，而成水肿。”[13]故宜将温补脾肾、利水化浊作为主要治则。

本研究选取的越婢加术汤中，麻黄为君药，性温，味辛、微苦，入肺经、膀胱经，具有利水消肿、发汗解表、宣肺平喘之功；白术为臣药，性温，味苦、甘，入脾、胃经，可健脾利水；石膏性大寒，味甘、辛，入肺、胃经，具有宣肺清热、除烦止渴之功；生姜性微温，味辛，入脾、肺、胃经，具有解表散寒、温肺止咳、温中止呕、解毒之功；大枣性温，味甘，入脾、胃经，可补脾和胃，补中益气，调营卫，解药毒；甘草性平，味甘，入脾、心、肺、胃经，具有清热解毒、润肺止咳、益气健脾、补中扶正、调和诸药之效。纵观全方，可达温补脾肾、利水消肿之效，紧扣DKD 脾肾阳虚证的病机要点。现代药理研究[14-15]证实，高、低剂量白术对大鼠阳虚型下焦水肿有积极影响，可降低尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）及尿蛋白含量；麻黄水煎液可通过降低肾脏水通道蛋白1/2（aquaporin 1/2，AQP1/2）表达而发挥对肾阳虚水肿大鼠的利水消肿作用。本研究结果显示，治疗3 个月后，观察组的总有效率为91.23%（52/57），对照组为70.18%（40/57），组间比较，观察组的临床疗效明显优于对照组，且观察组对主症积分和次症积分的降低作用均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示越婢加术汤对脾肾阳虚型DKD 患者疗效显著，有一定临床应用价值。同时，2组患者治疗后的空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1c）、SCr、24 h 尿蛋白、BUN 水平均较治疗前明显降低（P＜0.05 或P＜0.01），且观察组对上述指标的降低作用均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01），提示越婢加术汤有助于改善脾肾阳虚型DKD 患者的血糖指标和肾功能指标水平。

近年来，大量报道[16-17]均证实DKD的发生、发展与内质网应激（ERS）密切相关，DKD状态下ERS参与了肾小球系膜细胞、足细胞、肾小球内皮细胞损伤。目前调控ERS 已成为DKD 防治领域的热点之一，在中医药的防治研究中受到了广泛关注。葡萄糖调节蛋白78（GRP78）为ERS 中重要的分子伴侣蛋白，在ERS 相关疾病中呈异常高表达，被认为是ERS发生的标志蛋白[18]。蛋白激酶R样内质网激酶（PERK）通路为ERS 中的关键通路，ERS 发生时该通路最先启动。ERS 状态下，体内GRP78 从PERK 上解离后大量表达，而后PERK 经自身磷酸化激活，进而激活下游一连串反应，增加活化转录因子4（activating transcription factor 4，ATF4）表达水平，进一步激活C/EBP 同源蛋白（CHOP）基因而诱导细胞凋亡[19]。CHOP 是ERS 中间信号分子，也是ERS 介导凋亡过程中的关键蛋白，可被PERK/ATF4 通路激活[20]。已有研究[21]发现，DKD小鼠肾组织内GRP78、PERK表达量明显上调，CHOP 转录活性明显增强，小鼠CHOP 基因敲除后上述指标表达水平下降，其肾脏病变亦减轻。本研究中，2组患者治疗后的GRP78、PERK、CHOP mRNA 表达水平均较治疗前明显降低（P＜0.01），且观察组对GRP78、PERK、CHOP mRNA表达水平的降低幅度均明显优于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明越婢加术汤可能通过抑制内质网应激，从而起到延缓DKD 进展的作用。

综上所述，越婢加术汤治疗脾肾阳虚型DKD患者疗效确切，有助于缓解患者临床症状，改善患者肾功能和血糖水平，其疗效机制可能与抑制内质网应激有关。