基于分子印迹技术的电化学传感器检测吡虫啉的研究

王 琪

（沈阳建筑大学，辽宁 沈阳 110168）

吡虫啉（IMI）是一种新烟碱类农药，常应用于设施农业作为杀虫剂，可以有效控制刺吸式口器害虫，保证农产品质量。其对脊椎型动物毒性低，对昆虫毒性高，因此新烟碱类是全球最常用的杀虫剂。据调查，IMI的使用量超过了任何其他种类的杀虫剂，约占世界上所有杀虫剂的四分之一[1-4]。

尽管IMI具有很多优势，如高效、广谱性、相对较低的毒性，但它对人类的健康和环境造成了负担，大量使用的吡虫啉增加了作物上的农药残留量，引发了食物中毒事件，喷施后的农药污染环境，在空气、土壤以及水中造成污染[5-6]。因此，迫切需要可行和可靠的IMI测定方法。高效液相色谱法（HPLC）作为IMI检测的标准方法，因其优良的准确度、精密度和灵敏度而广泛应用于生产和监督[7-8]。然而，HPLC通常需要昂贵的设备和复杂的程序，因此不适用于IMI的快速和经济的分析。

分子印迹技术是一种可以合成具有特异性识别空穴的特殊材料的技术，具有良好的选择性和刚性，能够大大提高探测的敏感性[9]。运用分子印迹技术可以快速准确地检测出目标物，不需要复杂的样品前处理流程[10]。分子印迹电化学传感器是将分子印迹特异性材料与电化学分析装置结合起来，将目标物质浓度转化为电信号来获得检测浓度的装置。分子印迹电化学传感器设计简单、检测速度快[11]。目前，已经有研究各种类型的吡虫啉电化学性质传感器，并有着优异的准确度与精密性[12-14]。

本文以金纳米颗粒修饰玻碳电极，提高了电极反应过程的比表面积和响应电流值，以吡虫啉为模板分子物质，以邻苯二胺（o-PD）为主要作用功能聚合物单体，利用循环伏安法在聚集了金电层的电极上制备聚合物层，制作出吡虫啉分子印迹电化学传感器。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

华辰CHI610E电化学分析仪，上海市辰华仪器有限；玻碳电极用作工作电极、铂丝电极用作对电极、Ag/AgCl电极用作参比电极；IKA磁力搅拌器；可调功率超声清洗机，KQ5200DE，昆山市超声仪器有限公司；Thermo 超纯水仪，GenPure xCAD Plus。

邻苯二胺、吡虫啉、三水合四氯化金（HAuCl4·3H2O），阿拉丁试剂有限公司；铁氰化钾、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙酸、无水乙酸铵，国药集团化学试剂有限公司；氧化铝抛光粉，上海辰华仪器有限公司；硝酸、无水乙醇、硫酸，天津市化学试剂供销公司；实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 玻碳电极预处理

将麂皮固定在玻璃面板上，在表面撒上一定量的三氧化二铝粉末，再加入蒸馏水混合成糊状，手持电极，将电极垂直接触在麂皮表面，按照八字顺时针打磨电极，力度适当即可，打磨先后顺序为1.5 μm、0.5 μm、50 nm的三氧化二铝粉末，打磨后用超纯水冲洗表面直至光洁。在电极表面滴落一滴水珠，当水珠停留在电极镜面表面中而不是全覆盖整个电极平面即得到打磨效果良好的电极。然后将打磨后的电极放置于HNO3-H2O（体积比1∶1）溶剂中超声清洗3 min，之后将电极放置于无水乙醇中超声清洗3 min，最后在去离子水中超声清洗3 min，以去除表层杂质。然后将超声清洗后的电极放置于0.5 mol·L-1H2SO4溶液中活化电极。最后将处理好的电极放在铁氰化钾、氯化钾溶液中利用循环伏安法测试，若可逆电位差小于90 mV说明电极处理效果良好。

1.2.2 电化学传感器的制备

吡虫啉分子印迹电化学传感器的制备：首先配置5 mmol·L-1HAuCl4·3H2O、0.1 mol·L-1KCl混合溶液，将已经处理好的电极（GCE）置于溶液中，采用循环伏安法在电极表面修饰金电层，电压范围在0.2～1 V，聚合速率为50 mV·s-1，聚合10圈，超纯水冲洗，自然晾干即得到金纳米粒子修饰的电极（Au/GCE），金电层具有良好的导电性，可以增大电极的比表面积，有助于提高电极表面的电子传递速率，提高检测的灵敏度。然后将Au/GCE置于含4 mmol·L-1邻苯二胺、1 mmol·L-1吡虫啉、0.1 mmol·L-1HAuCl4·3H2O的醋酸盐缓冲溶液中。采用循环伏安法制备分子印迹膜，电压范围在-0.2～1.2 V之间，聚合速率50 mV·s-1，聚合15圈，去离子水冲洗，自然晾干。将晾干后的修饰电极浸入0.5 mol·L-1HCl溶液中磁力搅拌洗脱30 min，去离子水冲洗自然晾干即得对吡虫啉具有特异性识别性的印迹电极（MIP/Au/GCE），制备过程如图1所示，非印迹传感器（NIP/Au/GCE）除了不添加吡虫啉，制备过程与印迹传感器制备方法相同。

图1 吡虫啉分子印迹电化学传感器制备过程

1.2.3 分子印迹电化学传感器的性能及机理的电化学表征

通过电化学测试对电极进行电化学表征，选择差分脉冲法和循环伏安法对传感器进行检测，得到相关测试曲线，从而分析裸电极、吡虫啉印迹电极和非印迹电极以及孵育后印迹电极的机理。在三电极体系中，分别以不同状态下电极作为工作电极、铂丝电极作为辅助电极、Ag/AgCl电极作为参比电极。

循环伏安法测定参数：电位范围选择在-0.2～0.6 V之间，扫描速度为0.05 V·s-1。

差分脉伏安法测定参数：扫描电位范围-0.2～0.6 V，采样幅度2 mV，脉冲幅度6 mV。

两种测试方法均在0.2 mol·L-1、氯化钾5 mmol·L-1K3Fe(CN)6溶液中测试。将MIP/Au/GCE电极在吡虫啉溶液中孵育10 min，再在铁氰化钾探针溶液中利用循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV）检测吸附效果。

2 结果与讨论

2.1 吡虫啉传感器的制备与表征

电极表面电聚合的循环伏安图如图2所示。由图2（a）可以看出，未修饰金电层的印迹传感器（MIP/GCE）在循环伏安法聚合第1圈中0.63 V附近没有阳极峰，修饰金电层的传感器Au/NIP/GCE和Au/MIP/GCE电极分别在0.63 V和0.36 V处出现明显的不可逆阳极峰，如图2（b）、图2（c）所示。在电聚合过程中，质子化的o-PD单体作为电子给体与强氧化剂AuCl4-离子相互作用，形成o-PD低聚物使AuCl4-离子还原为AuNPs，AuNPs作为活性催化剂，促进了额外的o-PD单体的氧化聚合。随着聚合圈数的增加，氧化峰值电流显著降低，这意味着电极表面形成了绝缘聚钯层。在pH=5.2的醋酸盐缓冲液中，吡虫啉的硝基与o-PD上的质子胺基团之间的形成键嵌入到聚合物网络中。图2（c）表明，修饰金电层的非印迹电极（Au/NIP/GCE）的聚合过程与Au/MIP/GCE相似，因为吡虫啉的电活性较低，不影响电聚合过程中的电流响应。

图2 电极表面电聚合的循环伏安图

2.2 分子印迹电化学行为分析

通过循环伏安法分析传感器制备过程，如图3所示。与裸电极（曲线a）相比，当修饰金电层到电极表面后，峰电流值变大（曲线b），这是由于金纳米粒子增加电极的表面积，同时提高了电子的传递速率。当印迹电极表面负载了大量的不导电的分子印迹聚合物，探针离子只能通过特异性空穴到达电极表面，所以Au/MIP/GCE 电极（曲线c）峰电流值变小。Au/NIP/GCE电极（曲线d）由于表面形成了不导电的、致密厚实的聚合物，且无印迹位点，阻碍了探针离子的扩散，故峰电流值很小，几乎为0。

图3 不同修饰电极的循环伏安图

2.3 实验条件优化

在pH为3～7的范围，考察了不同pH醋酸盐缓冲溶液对印迹传感器性能的影响，结果显示当聚合液pH为5.2时印迹传感器的检测性能最佳，所以选择pH为5.2的醋酸盐缓冲溶液为电解质溶液。

适当的聚合圈数有助于提高印迹空穴量。过高的聚合物圈数也会造成与电极反应的表面聚合层厚度过高，洗脱的反应难度也提高，特异性吸附空穴数量减少；过少的聚合圈数会降低聚合层与电极之间的紧密度，引起聚合膜脱落。为了提高传感器检测性能，考察了聚合圈数对响应电流的影响，结果显示响应电流随着聚合圈数的增加呈现先增后降的趋势，在设定聚合圈数为15圈时，测试的响应电流值最大，所以本实验的最优聚合条件为15圈。

探讨了不同洗脱时间对洗脱效果的影响，结果显示随着洗脱时间的增加，响应电流值呈增大的趋势，且在洗脱30 min后响应电流值不再发生变化，所以最佳洗脱时间为30 min。

将印迹电极置于1×10-5mol·L-1吡虫啉溶液中进行吸附测试，孵育不同时间后，进行DPV测试，孵育时间越长响应电流值越低，当孵育到10 min之后响应电流稳定在一定值，这是因为吡虫啉在特异性吸附后达到了平衡，所以最佳孵育时间为10 min。

2.4 分子印迹膜厚度的确定

分子印迹膜厚度达到纳米级别时，传质效果和吸附速率最优。玻碳电极在1 mmol·L-1的吡虫啉和4 mmol·L-1o-PD的pH=5.2醋酸盐缓冲液中进行电聚合。用电量计算法[15]计算聚合膜的厚度，公式如式（1）所示。

式中：m—功能单体的质量，取4.326 mg；

Q—聚合过程中的总电量，在本次聚合过程中为0.1803 C；

F—法拉第常数，9.65×104C·mol-1；

A—电极表面积；

ρ—聚合膜的分子密度，g·cm-2，用o-PD的分子密度作为高分子的分子密度。

根据公式（1）算出薄膜的层厚为92 nm。

2.5 线性关系与检测限结果

在最佳实验条件下，配置含有1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9、1×10-10、1×10-11mol·L-1吡虫啉标准溶液，将聚合电极在上述溶液中孵育10 min后，利用DPV法检测，并将检测结果绘制标准曲线，如图4所示。由图4可以看出，吡虫啉浓度越大，响应电流值越低，并在1×10-4～1×10-12mol·L-1范围内成良好的线性关系，经实验确定其检测限为1×10-12mol·L-1，线性方程为I=-5.323 81X+19.423 57，相关系数为0.995 09。

图4 不同浓度吡虫啉的DPV曲线

2.6 实际样品检测

为验证Au/MIP/GCE传感器在实际样品中的检测效果，对小白菜样品上的吡虫啉进行了加标回收实验。将小白菜捣碎，乙腈溶液浸泡萃取，制得样品溶液。利用该样品溶液分别加入浓度为1、0.1 μmol·L-1吡虫啉溶液，在最佳实验条件下，使用传感器对样品进行测试，结果如表1所示。由表1可知，实验得到的回收率为104.6%～105.7%，RSD为1.52%～1.65%。结果证明，该传感器对实际样品中IMI的测量是很有效的，并且拥有优异的精密度和准确性。

表1 小白菜样品中IMI的回收实验

3 结 论

本研究构建了一种聚合了金电层的吡虫啉分子印迹传感器。在1×10-4～1×10-12mol·L-1浓度区域内印迹传感器对吡虫啉有良好的线性，检出限为1×10-12mol·L-1，对吡虫啉品加标回收率为104.6%～105.7%，RSD为1.52%～1.65%。该吡虫啉分子印迹传感器具有良好的选择性、灵敏性，可实现对实际样品中吡虫啉的快速检测。