铁超载调控氧化性低密度脂蛋白诱导泡沫细胞促动脉粥样硬化活化的作用

2024-03-05 09:11王晓燕邹小义祝翔王婷强叶涛周思源张鹏张平

实用医学杂志 2024年3期

王晓燕邹小义祝翔王婷强叶涛周思源张鹏张平

1南京医科大学附属常州第二人民医院检验科（江苏常州 213000）；2德安医院康复科（江苏常州 213000）；3江苏省人民医院检验科（南京 210029）；4扬中市人民医院检验科（江苏镇江 212200）

动脉粥样硬化（AS）是心血管病最常见的动脉壁异常综合征。巨噬细胞和平滑肌细胞的泡沫化是AS 病理过程中的标志。研究表明铁代谢异常亦是AS 的危险因素之一，铁代谢紊乱所致的胞内铁超载可通过Fenton 反应［1］产生ROS，加重体内低密度脂蛋白的氧化［2］，而脂质过氧化又是AS 形成的关键。已有研究证实铁离子对大多数细胞均可造成氧化应激损伤，如脑组织中铁含量的升高会加速脑内皮细胞的衰老，引起阿尔茨海默病等神经系统疾病［3］，软骨细胞的铁超载会增加膝关节炎的发病率［4］等。铁超载引起的内皮功能障碍［5-6］及促炎巨噬细胞生成［7］增加了AS 的发病率，但铁超载对泡沫细胞的作用还尚不清楚，其是否促进泡沫细胞向促AS 表型转化，还鲜有报道。因此，本研究建立泡沫细胞模型，旨在观察铁超载对促进泡沫细胞向促AS 表型转化的影响，探讨其在AS 活化中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料MOVAS 细胞株购于中科院上海细胞研究所；氧化性低密度脂蛋白（oxLDL），去铁胺，普鲁士蓝染色试剂盒，油红O 染色试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；柠檬酸铁铵，购自北京伊塔生物科技有限公司。柠檬酸铁铵购于美国Sigma 公司，ROS 检测试剂盒购于Beyotime 公司，MDA 和GSH 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，GPX4 检测试剂盒购自酶免上海瑞番生物科技有限公司，CCK-8 购自美国MCE 公司；Trizol试剂购于Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养MOVAS 细胞分为media 组、ox-LDL组、oxLDL + FC组、oxLDL + FC + DFO组。配制50 mmol DFO 和200 mmol FC 母液用于后续研究。细胞扩增培养，调至浓度为5 × 104个细胞/mL，接种于96孔板中，每孔加100 μL培养液，37℃ 5% CO2培养箱培养。待细胞60%粘连后，去掉完全培养液，加入基础培养液100 mL，饥饿培养12 h。按组分别加入含铁元素200 μmol的FC和100 μmol DFO，孵育1 h。加入50 μg/mL 的oxLDL 刺激细胞24 h 后检测。

1.2.2 CCK-8 检测每孔加入15 μL 的CCK-8，37 ℃，5% CO2培养箱内避光孵育3 h。酶标仪450 nm 波长测OD值，分析细胞增殖情况。

1.2.3 ROS 检测每孔按1∶1 000 比例加入DHE探针，37℃，5% CO2培养箱内避光孵育30 min。荧光显微镜下观察拍照。

1.2.4 ELISA 检测每孔加入样本，酶标抗体后孵育，洗涤后加底物显色，酶标仪读取吸光度，计算蛋白含量。

1.2.5 RT-qPCR 检测收集标本，加入Trizol。利用氯仿、异丙醇、乙醇提取总RNA，逆转录成cDNA，用于扩增。结果采用2-△△CT法分析目的基因在各组之间的表达。各靶基因引物序列见表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence

1.2.6 普鲁士蓝染色细胞种植铺板，PBS 洗涤后4%多聚甲醛固定，蒸馏水洗涤，加入普鲁士蓝染液，蒸馏水洗涤后显微镜下拍照。图中蓝绿色代表铁沉积。

1.2.7 油红O 染色细胞种植铺板，PBS 洗涤后油红O 固定25 min 弃去，蒸馏水洗涤，60%异丙醇30 s 后弃去，油红O 染料浸染20 min 弃去，60%异丙醇分化至无背景色，水洗，苏木精复染2 min，油红O 缓冲液孵育1 min 弃去。加蒸馏水覆盖细胞并在倒置显微镜下拍摄照片以观察细胞泡沫化的程度。图中红色代表泡沫细胞。

1.2.8 统计学方法数据采用SPSS 19.0 统计分析，以均数±标准差表示。组间比较采用t检验，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 铁超载模型的建立oxLDL + FC 组中的两种细胞均观察到明显的蓝绿色铁沉积。DFO 处理后，oxLDL + FC + DFO 组的蓝绿色铁沉积显著减轻（图1）。

图1 RAW264.7 和MOVAS 细胞普鲁士蓝染色（标尺=100 μm）Fig.1 RAW264.7 and MOVAS cell iron deposition by Prussian Blue staining （scale=100 μm）

2.2 铁超载参与oxLDL 诱导的泡沫细胞的生成与oxLDL 组比较，oxLDL+FC 组呈现更明显的红色（图2），且负责胆固醇流出的主要分子ATP结合盒转运体A1（ABCA1）和ATP 结合盒转运体G1（ABCG1）mRNA 表达降低（P＜ 0.05），见表2-3。DFO 预处理后，与oxLDL+FC 组比较，oxLDL+FC+DFO组红色显著减少（图2）。并且，ABCA1和ABCG1 mRNA 表达显著增加（P＜ 0.05），见表2-3。

图2 RAW264.7 和MOVAS 细胞油红O 染色（标尺=50 μm）Fig.2 RAW264.7 and MOVAS cell were stained with Oil Red O （scale=50 μm）

表2 RAW264.7 和MOVAS 细胞的ABCA1 mRNA 水平Tab.2 The mRNA expression of ABCA1 in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

注：与oxLDL + FC组比较，*P ＜ 0.05

组别media组oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组RAW264.7 1.000 ± 0.014 0.809 ± 0.036*0.721 ± 0.033 1.835 ± 0.120*MOVAS 1.002 ± 0.084 0.082 ± 0.078*0.602 ± 0.061 1.673 ± 0.123*

表3 RAW264.7 和MOVAS 细胞的ABCG1 mRNA 水平Tab.3 The mRNA expression of ABCG1 in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

注：与oxLDL+FC组比较，*P ＜ 0.05

组别media组oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组RAW264.7 1.003 ± 0.085 0.893 ± 0.016*0.768 ± 0.061 1.537 ± 0.124*MOVAS 1.004 ± 0.112 0.679 ± 0.073 0.591 ± 0.058 1.367 ± 0.053*

2.3 铁超载调控oxLDL 诱导的泡沫细胞脂质过氧化反应与oxLDL 组比较，oxLDL + FC 组两种细胞来源的泡沫细胞存活率（图3）和活性（表4）均显著降低（P＜ 0.05），泡沫细胞ROS 和MDA 的含量明显增加，GPX4 的表达明显降低（P＜ 0.05），但对于GSH 含量，仅在平滑肌细胞中显著减少，而巨噬细胞中差异无统计学意义（P＞ 0.05）（图4，表5-7）。DFO 处理后，oxLDL + FC 组比较，oxLDL + FC +DFO 组的细胞存活率和活性明显提高（P＜ 0.05）（图3，表4）。同时以上所有铁超载环境中加重的过氧化反应均有所减轻（图4，表5-7）。

图3 光镜观察RAW264.7 和MOVAS 细胞的存活情况（标尺=200 μm）Fig.3 The survival of RAW264.7 and MOVAS cell via light microscopy （scale=200 μm）

图4 DHE 探针观察RAW264.7 和MOVAS 细胞ROS 的生成（标尺=50 μm）Fig.4 The ROS generation of RAW264.7 and MOVAS cell by DHE probe （scale=50 μm）

表4 CCK-8 实验检测RAW264.7 和MOVAS 细胞活性Tab.4 The relative cells activity of RAW264.7 and MOVAS via CCK-8 assay ±s，%

注：与oxLDL+FC组比较，*P ＜ 0.05

组别media组oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组RAW264.7 100.000 ± 2.624 70.672 ± 1.860*43.800 ± 2.694 52.918 ± 3.079*MOVAS 100.000 ± 1.676 77.981 ± 3.220*45.493 ± 2.340 61.263 ± 1.690*

表5 RAW264.7 和MOVAS 细胞的MDA 水平Tab.5 The content of MDA in RAW264.7 and MOVAS cells ±s，nmol/mL

注：与oxLDL+FC组比较，*P ＜ 0.05

组别media oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组MOVAS 1.267 ± 0.123 1.892 ± 0.219*2.464 ± 0.244 1.873 ± 0.224*RAW264.7 0.766 ± 0.078 1.316 ± 0.088*2.386 ± 0.140 1.665 ± 0.096*

表6 RAW264.7 和MOVAS 细胞的GPX4 含量Tab.6 The content of GPX4 in RAW264.7 and MOVAS cells ±s，pg/mL

注：与oxLDL+FC组比较，*P ＜ 0.05

组别media oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组MOVAS 337.801 ± 28.104 347.435 ± 38.656*240.760 ± 17.360 284.464 ± 18.562*RAW264.7 316.075 ± 11.402 281.403 ± 31.398*205.787 ± 28.654 285.066 ± 32.690*

表7 RAW264.7 和MOVAS 细胞的GSH 含量Tab.7 The content of GSH in RAW264.7 and MOVAS cells ±s，μmol/gprot

注：与oxLDL+FC组比较，*P ＜ 0.05

组别media组oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组MOVAS 31.267 3 ± 4.244 8 21.390 4 ± 0.339 2 22.878 9 ± 2.046 6 28.734 3 ± 0.968 3*RAW264.7 40.897 5 ± 3.602 1 21.497 3 ± 4.610 4 23.643 7 ± 2.657 7 32.180 1 ± 1.544 8*

2.4 铁超载参与oxLDL诱导的泡沫细胞促动脉粥样硬化表型的转化与oxLDL 组比较，oxLDL+FC组巨噬细胞促炎M1 型标志物iNOS 和平滑肌细胞合成型标记物OPN显著增加，平滑肌细胞收缩型标志物α-SMA、平滑肌肌球蛋白重链11（MYH11）明显下降（P＜ 0.05），而平滑肌收缩型标志物SM22a和抗炎M2 型标志物Arg-1 mRNA 无明显变化（P＞0.05）。DFO 处理后，与oxLDL + FC 组相比，Arg-1、α-SMA、MYH11 和SM22a 均显著增加，iNOS 和OPN显著降低（P＜ 0.05）。见表8-9。

表8 RAW264.7 细胞的iNOS 和Arg-1 mRNA 水平Tab.8 The mRNA expression of iNOS and Arg-1 in RAW264.7 cells ±s

注：与oxLDL+FC组比较，*P ＜ 0.05

组别media oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组iNOS 1.000 ± 0.012 1.959 ± 0.024*2.720 ± 0.061 2.251 ± 0.198*Arg-1 1.001 ± 0.063 1.089 ± 0.126 1.120 ± 0.128 1.405 ± 0.049*

表9 MOVAS 细胞的α-SMA、SM22a、MYH11、OPN mRNA 水平Tab.9 The mRNA expression of α-SMA、SM22a、MYH11 and OPN in MOVAS cells ±s

注：与oxLDL+FC组相比，*P ＜ 0.05

组别media组oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组OPN 1.001 ± 0.067 1.148 ± 0.091*2.271 ± 0.033 1.428 ± 0.123*α-SMA 1.001 ± 0.053 0.594 ± 0.037*0.392 ± 0.024 0.770 ± 0.014*SM22a 1.002 ± 0.083 0.786 ± 0.117 0.602 ± 0.073 0.971 ± 0.127*MYH11 1.001 ± 0.063 0.682 ± 0.029*0.411 ± 0.021 0.653 ± 0.032*

2.5 铁超载加重oxLDL 诱导的泡沫细胞炎症反应与oxLDL 组比较，铁超载环境加强了TNF-α、IL-1β mRNA 的表达（P＜ 0.05），而DFO 处理后，TNF-α、IL-1β 的mRNA 表达较oxLDL+FC 组显著降低（P＜ 0.05）。见表10-11。

表10 RT-qPCR 检测RAW264.7 和MOVAS 细胞的TNF-α mRNA 水平Tab.10 The mRNA expression of TNF-α in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

组别media组oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组RAW264.7 1.005 ± 0.120 1.610 ± 0.203*3.315 ± 0.223 1.601 ± 0.252*MOVAS 1.008 ± 0.157 2.517 ± 0.329*5.417 ± 0.183 3.803 ± 0.326*

表11 RAW264.7 和MOVAS 细胞的IL-1β mRNA 水平Tab.11 The mRNA expression of IL-1β in RAW264.7 and MOVAS cells ±s

注：与oxLDL+FC组比较，*P ＜ 0.05

组别media组oxLDL组oxLDL+FC组oxLDL+FC+DFO组RAW264.7 1.001 ± 0.041 1.514 ± 0.145*2.826 ± 0.177 1.754 ± 0.055*MOVAS 1.006 ± 0.133 1.695 ± 0.171*3.600 ± 0.183 1.772 ± 0.363*

3 讨论

本研究选用RAW264.7 和MOVAS 细胞株建立AS 泡沫细胞模型，观察铁超载与泡沫细胞促AS活化的关系。结果发现铁超载促进巨噬细胞和平滑肌细胞吸收oxLDL 向泡沫细胞转化，且胆固醇逆向转运分子ABCA1 和ABCG1 mRNA 水平显著下降。这意味着铁超载促进胞内胆固醇沉积可能由ABCA1 和ABCG1 表达降低所致。进一步研究发现，铁超载实验组细胞死亡率显著升高，ROS 和MDA 含量增加，表明过量铁对细胞产生明显毒性，加重细胞过氧化损伤。众所周知，GPX4 作为保护生物膜不受氢过氧化损伤的GPX 分子，通过消耗细胞内GSH 抑制磷脂和胆固醇的氢过氧化反应［8］。本实验中，铁超载引起GPX4 显著降低，导致ROS 的积累，促进细胞脂质过氧化，但巨噬细胞GSH 含量与oxLDL 组相比却没有明显变化，推测对于巨噬细胞，铁超载可能通过其他方式影响GPX4，而不是耗竭GSH。但在DFO 治疗后，GPX4和GSH 含量均显著上升，表明去除过量铁即可恢复细胞抗氧化能力。

巨噬细胞和平滑肌细胞是AS 发病过程中的重要参与细胞，其功能会随着病情的进展发生改变并相互作用，如巨噬细胞极化与平滑肌细胞表型转化［9-11］。在AS 病程中，由于机体微环境改变，促使巨噬细胞极化为促炎M1 型和抗炎M2 型并参与铁代谢，M1 型分泌促炎因子促使晚期斑块破裂并表达高水平的铁储存蛋白和低水平的运铁素（FPN）来维持胞内铁超载状态，反之，M2 型分泌抑炎因子在AS 初期稳定斑块并表达低水平的铁储存蛋白和高水平的FPN 以利于铁外流［12-13］。在斑块初期血管中平滑肌细胞以增殖为主，促进纤维帽生成以稳定斑块［11］。随着斑块进展，平滑肌细胞出现异常转化，由收缩型向合成型转换，下调原有的收缩型标志物α-SMA、MYH11 和SM22a 等，上调骨桥蛋白（OPN）等合成型标志物，甚至向巨噬细胞样转变［14-15］，致使正常表型的平滑肌细胞数量减少，最终导致纤维帽变薄，斑块破裂［11］。本实验证实了铁超载能够促使促炎M1 型巨噬细胞和收缩型平滑肌细胞的生成，并释放炎症因子（TNF-α、IL-1β）。所有这些变化在DFO 处理后均出现逆转。

此外，研究［16-18］表明GPX4 活性降低，则对铁死亡现象更敏感，其失活是导致脂质过氧化物积累的原因。铁死亡是一种以脂质过氧化积累为特征的铁依赖性细胞凋亡，是以GSH 消耗，抗氧化体系GPX4 失活，ROS 大量生成为特征的炎症反应［18-19］。虽然本实验中，铁超载组部分数据支持了铁死亡现象，但遗憾的是，DFO 却不是铁死亡的特异性阻断剂，我们未能从反面验证铁死亡的存在。即便如此，我们依然看到了DFO 具有一定的抗AS 作用，这与BAI 等［20］利用DFO 部分抑制oxLDL 诱导的小鼠主动脉内皮细胞铁死亡的现象相符。

综上所述，本研究证实外源性铁超载促进oxLDL 诱导的巨噬细胞和平滑肌细胞源性泡沫细胞的生成，加重脂质过氧化和炎症反应，促使细胞向促动脉粥样硬化表型转化。但铁超载在AS中的机制研究目前还处在初步阶段，与铁死亡究竟是何关系，是否激活铁死亡途径且如何发挥作用，还需深入研究。我们相信通过对泡沫细胞中铁代谢的深入研究，将为AS 的预防和治疗找到新的方案。