LncRNA SENCR靶向miR-206调控人主动脉夹层血管平滑肌细胞增殖和凋亡

马润伟 穆纯杰 桂雯婷 邓瑶 赵敏章 柳民 宋怡

云南省阜外心血管病医院1心血管外科，2体外循环科 （昆明 650102）

主动脉夹层（aortic dissection， AD）是一种发生在主动脉壁内层撕裂的心血管疾病，在世界范围内具有很高的发病率和病死率［1］。主动脉内壁的撕裂导致血液通过撕裂进入血管壁。AD 患者主动脉发生血管平滑肌细胞丢失、中膜细胞外基质降解、炎症细胞浸润等病理改变［2］。AD 患者主动脉壁的典型特征包括弹性纤维断裂和丢失，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell， VSMC）丢失，粘多糖积累［3］。细胞增殖抑制、细胞凋亡、坏死和自噬增强都是导致主动脉壁VSMC 丧失的可能原因［4-5］。VSMC 的增殖和凋亡的动态平衡在多种心血管疾病中起着重要作用。

在心血管细胞生物学和动脉粥样硬化的病理过程中，非编码RNA（ncRNAs）调节关键的细胞和分子过程［6］，包括细胞增殖、侵袭和存活，脂质的细胞摄取和外排，促炎和抗炎介质的表达和释放，以及蛋白水解平衡［7］。有报道称lncRNAs 在冠状动脉粥样硬化［8］、扩张型心肌病［9］和心力衰竭［10］等心血管疾病中发挥重要作用。据报道，平滑肌和内皮细胞富集迁移/分化相关lncRNA（smooth muscle and endothelial cell-enriched migration/differentiation associated lncRNA，SENCR）在冠心病患者外周血中低表达，SENCR 可以抑制平滑肌细胞的增殖、迁移并阻滞细胞周期［11］，稳定平滑肌细胞的收缩表型［12］。SENCR 在腹主动脉瘤中表达降低，过表达SENCR 后可以通过抑制VSMC 凋亡和细胞外基质降解来抑制腹主动脉瘤的形成［13］。SENCR在高葡萄糖暴露的平滑肌细胞中，其过表达可逆转高葡萄糖对小鼠VSMC 增殖和迁移的影响［14］。因此，研究SENCR 在AD 中的功能和调控机制，有助于进一步阐明AD 的分子治疗靶点。LncRNA 表达异常可靶向调控miRNAs 在多种疾病，如帕金森病［15］、癌症［16］中发挥重要作用。miR-206 通过转录后调控影响肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡［17］。然而，lncRNA SENCR 靶向miR-206 对AD 的调控及其相关作用机制尚不清楚。因此，本研究探讨lncRNA SENCR 靶向miR-206 对HVSMC 增殖和凋亡的影响，旨在初步探讨SENCR 在主动脉夹层中的表达变化及其对人血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及潜在分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料选取2019 年3 月至2021 年5 月云南阜外心血管医院手术切除的主动脉夹层组织15 例，同时收集同期该院外伤患者正常主动脉血管组织15 例。样本采集均经过患者同意和近亲亲属同意。本研究得到云南省阜外心血管病医院伦理委员会批准（编号：2020-032-1）。人主动脉血管平滑肌细胞购买于江苏齐氏生物科技有限公司。HE 染色试剂盒（G1120）购于北京索莱宝科技有限公司；CCK-8 检测试剂盒（C0037）和Annexin V/PI双染检测试剂盒（C1062M）购于上海碧云天生物技术有限公司；FISH 探针试剂盒购于上海吉玛；TRIzol（15596018）购于Invitrogen 公司；miRNA 提取试剂盒（RN0501）、miRNA 逆转录试剂盒（PC4801）和miRNA qPCR 试剂盒（PC6301）购于北京艾德莱生物科技有限公司；RNA 逆转录试剂盒（RR036Q）和SYBR Green Premix（RR420A）购于Takara 公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（E1910）购于Promega 公司。

1.2 HE 染色样本经4%多聚甲醛固定24 h 后，常规石蜡包埋，切片4 μm。用二甲苯脱蜡2 次，每次5 min；再用梯度乙醇（100%、95%、85%、75%）复水，每梯度3 min；蒸馏水浸泡2 min；苏木精染液染色10 min 后蒸馏水冲洗；分化液分化1 min 后进行流水冲洗5 min；然后伊红染液进行染色2 min，染色后用梯度乙醇完成脱水，75%、85%、95%、100%乙醇、100%乙醇各浸洗1次，每次1 min。二甲苯透明2 次，每次1 min，中性树胶封片，于显微镜下观察拍照。

1.3 荧光原位杂交（FISH）检测针对SENCR 目的基因、阳性对照18S 及阴性对照，探针序列如下：SENCR probe 基因DNA 序列（5'-3'）：CTGGCTGAATGAGGAGCAATGTGGCTG；18S probe：CTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTC。将人血管平滑肌细胞按2 × 104细胞/孔的密度将贴壁细胞接种于24 孔板中，按照FISH 试剂盒说明书进行实验操作，实验结束后将细胞爬片细胞面朝下盖在载玻片上于荧光显微镜下观察拍照。

1.4 RT-qPCR 检测组织中SENCR 和miR-206 的表达水平分别提取组织和细胞中总RNA 和miRNA，逆转录合成cDNA。建立RT-qPCR 反应体系，循环扩增40 次。引物序列如下，SENCR：FCAGCCAGAAAGGACTCCAACTCC，R-GGAGGCAGCTGGTGCTGAAAG；miR-206：F-TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG；U6：F-CTCGCTTCGGCAGCACA；GAPDH：F-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG，RGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT。SENCR 表达水平以GAPDH为内参，miR-206表达水平以U6为内参。所得循环值通过2-ΔΔCt法计算SENCR 和miR-206 表达水平。

1.5 细胞培养和转染分别用过表达质粒pc-DNA3.1-SENCR 和空载体pcDNA3.1 转染HVSMCs。转染后分为：正常细胞为Control 组、转染空载体细胞为NC 组、转染过表达质粒pcDNA3.1-SENCR 细胞为SENCR 组对转染结果进行验证。转染方法简述如下：将处于对数生长期的HVSMCs 接种于6 孔细胞培养板，观察每孔细胞融合度达80%时进行细胞转染。用50 μL 无血清DMEM 培养基稀释质粒及5 μL Lipofectamin 2000 转染试剂，室温轻轻混匀后放置5 min；然后室温轻轻将稀释后的质粒与转染试剂混匀后室温静置20 min，然后将混合液加入细胞培养板，培养48 h 后收集细胞进行后续检测。

1.6 CCK-8 细胞增殖检测将HVSMCs 细胞消化后制成细胞悬液，以每孔100 μL 接种于96 孔板预培养24 h，同时设置空白组和对照组。沿细胞培养板板壁向每孔加入100 μL 的CCK-8 溶液，置于培养箱中继续培2 h，使用酶标仪测量各孔的吸光值。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡收集细胞后添加结合缓冲液溶液400 μL，然后加入Annexin VFITC 溶液5 μL，混合均匀以后，放在4 ℃避光条件孵育15 min；再加入PI 溶液10 μL，同在4 ℃避光条件孵育15 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡变化。

1.8 生物信息学和双荧光素酶报告基因实验预测和验证SENCR 的靶基因通过生物信息学数据库TargetScan 预测miR-206 与SENCR 基因的结合位点。将NC 或miR-206 mimic 和psiCHECK2 或SENCR-WT 或SENCR-MUT 荧光素酶报告载体共转染HVSMCs。48 h 后，根据荧光素酶报告基因检测试剂盒操作步骤检测每组HVSMCs 细胞的相对荧光素酶活性。

1.9 统计学方法采用 GraphPad Prism 5.0 软件分析实验数据，以均数±标准差表示，两组数据间比较用t检验，多组差异比较用单因素方差分析，以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FISH及HE染色FISH检测结果显示，SENCR定位于细胞核与细胞质（图1）。且SENCR 在正常的主动脉组织中表达较高，而在夹层组织中表达显著降低（P＜ 0.001，图2A、B）。正常血管组织和夹层组织的病理形态相比，正常主动脉组织表现为完整、连续的主动脉结构（内膜、中膜和外膜），而AD 组血管中膜大量变性，形成空腔，纤维紊乱，内膜与中膜分离（图2C）。

图1 FISH 检测SENCR 在HVSMCs 中的定位和表达情况Fig.1 Localization and expression of SENCR in HVSMCs detected by FISH

图2 SENCR 在正常主动脉及夹层组织中的表达情况Fig.2 Expression of SENCR in normal aorta and dissection

2.2 过表达SENCR 对HVSMC 细胞增殖的影响转染结果显示，SENCR 组中SENCR 的表达水平显著提高（P＜ 0.001，图3A）。在24、48、72 h，SENCR 组细胞活力明显低于NC 组（P＜ 0.001，图3B），说明SENCR 基因过表达能够有效抑制血管平滑肌细胞的增殖活力。

图3 SENCR 表达对HVSMC 细胞增殖的影响Fig. 3 The effect of SENCR expression on the proliferation of HVSMC cells

2.3 过表达SENCR 对 HVSMCs 细胞凋亡的影响与NC 组相比，过表达SENCR 后，HVSMCs 细胞表现出明显的细胞早期凋亡（P＜ 0.001，图4）。

图4 SENCR 表达对HVSMC 细胞凋亡的影响Fig.4 The effect of SENCR expression on apoptosis of HVSMCs

2.4 SENCR 和miR-206 的在夹层中表达及相关性分析与正常组相比，SENCR 在主动脉夹层中表达下调（P＜ 0.01，图5A），而miR-206 在主动脉夹层中表达显著上调（P＜ 0.01，图5B）。在主动脉夹层组织中，SENCR 与miR-206 表达呈负相关（P＜ 0.01，图5C）。

图5 SENCR 和miR-206 在夹层组织中的表达及SENCR 转染验证Fig.5 Expression of SENCR and miR-206 in Sandwich Tissue and Verification of SENCR Transfection

2.5 SENCR 靶向调控miR-206通过生物信息学数据库分析显示，SENCR 的潜在靶基因可能是miR-206（图6A）。共转染SENCR-WT 和miR-206模拟物的细胞相对荧光素酶活性较共转染SENCR-WT 和miR-206 对照物的相对荧光素酶活性降低（P＜ 0.01，图6B）。共转染SENCR-MUT 和miR-206 模拟物的细胞相对荧光素酶活性较共转染SENCR-MUT 和miR-206 对照物的无显著差异（P＞ 0.05，图6B）。在转染pcDNA3.1-SENCR 过表达质粒的HVSMCs 中，上调SENCR 可显著降低miR-206 的表达（P＜ 0.001，图6C）。

图6 SENCR 与miR-206 靶点结合情况Fig.6 Binding of SENCR to miR-206 targets

3 讨论

主动脉平滑肌细胞是构成动脉血管壁的主要细胞，HVSMC 的功能作用及稳定状态在AD 中发挥着重要作用［18］，因此明确HVSMC 增殖和凋亡的分子机制在AD 治疗中具有重要意义。研究［19］显示，lncRNA 表达异常是介导主动脉平滑肌细胞增殖、凋亡等功能障碍，诱发主动脉夹层的关键因子。研究［20］发现，颅内动脉瘤患者的血液中lncRNA HIF1A-AS1 的表达水平与颅内动脉瘤呈正相关，HIF1A-AS1 过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖。LncRNA H19 在AD 患者胸主动脉组织中异常高表达，可通过竞争结合并抑制miR-193b-3p 来调控平滑肌细胞功能并参与AD 的发展进程［21］。本研究显示，SENCR 在主动脉夹层组织中的表达显著降低，提示AD 发展可能与SENCR 异常表达有关。为分析SENCR 在AD 中的功能，本研究转染SENCR 到HVSMC 并分析其增殖和凋亡的作用及潜在调控机制。

SENER 是在血管平滑肌细胞和内皮细胞中特异表达的lncRNA，位于11 号染色体上，是白血病病毒整合I（FLI1）基因的反义lncRNA，是细胞质lncRNA，可分为合成型和收缩型2 种亚型［22］。研究报道，SENCR 过表达可以抑制血管平滑肌细胞的增殖［11］、迁移和表型转换［23］。本研究中我们发现SENCR 主要在血管平滑肌细胞的胞核和胞质内表达，SENCR 在主动脉夹层患者组织中的表达量明显低于健康者，其在主动脉夹层的形成过程中可能发挥负调控作用。调控HVSMC 的增殖和凋亡，是研究心血管疾病，如腹主动脉瘤的预防、诊疗和预后的有效方法［24］。本实验通过转染过表达质粒使SENCR 在人主动脉平滑肌细胞中过表达，发现SENCR 过表达会显著抑制HVSMC 增殖，这与前人研究表明SENCR过表达对HVSMC的抗增殖作用一致。SENCR异常表达导致AD发生可能与其低表达促进主动脉血管平滑肌细胞过度增殖，使主动脉发生重塑有关。以上研究表明，SENCR 可能成为主动脉夹层诊断的生物标志物，调控SENCR 表达可能是AD 治疗的重要干预措施。

LncRNA-miRNA-mRNA 轴在AD 发展进程中发挥着关键作用［25］。在心血管疾病中，LncRNA 可以通过与靶基因miRNA 结合，负向调控靶基因miRNA 的表达，参与血管平滑肌细胞的凋亡、增殖等［26-27］。本研究显示，本研究通过数据库预测，SENCR 的靶基因miRNA 可能是miRNA-206。双荧光素酶报告基因验证SENCR 可靶向结合miRNA-206。研究［15］发现，miR-206 可以通过转录后调控影响肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡。本研究检测到miR-206 在AD 中表达显著上调。Pearson 相关性分析发现，在AD 中SENCR 与miR-206 表达呈负相关，SENCR 过表达导致miR-206 表达下调，表明SENCR 可通过靶向负调控miRNA-206 的表达而影响HVSMC 的增殖和凋亡。因此，靶向调控SENCR/miR-206 途径可能是AD 的潜在治疗策略。

综上所述，本研究表明主动脉夹层患者组织中SENCR 表达显著降低，SENCR 与主动脉夹层的形成及发展密切相关。过表达SENCR 可通过降低miRNA-206 表达水平，抑制血管平滑肌细胞的增殖并促进凋亡，但SENCR/miR-206 轴在AD 中发挥作用的关键下游靶基因还需进一步研究。本研究对SENCR 在HVSMC 中的功能研究为AD 的发生机制及预测提供了新的方向。