蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子分泌的调节作用

丁丽宏 耿世佳 王玉杰

1内蒙古医科大学附属医院（呼和浩特 010050）；2内蒙古医科大学基础医学院（呼和浩特 010110）

肺炎链球菌为肺炎的主要病原之一，肺炎发生后临床多表现为打喷嚏、面颊绯红、流鼻涕、咳痰等，在肺炎发展过程中肺泡上皮细胞凋亡发挥着重要作用，可推动肺炎疾病进展［1-3］。有关研究［4-6］表明，中药具有价廉、广谱抗菌、调节免疫等特点，为肺炎的良好治疗手段，采用中药对肺泡上皮细胞凋亡进行抑制可有效防治肺炎链球菌肺炎，蟛蜞菊内酯是具有降血脂、抗氧化、抗炎等作用的菊科植物墨旱莲主要成分之一，蟛蜞菊内酯可通过减轻炎症细胞浸润抑制肺泡上皮细胞损伤。本研究以肺泡上皮细胞A549 为研究对象，并以蟛蜞菊内酯为切入点，探究蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞凋亡及炎症因子分泌的调节作用，以期为肺炎链球菌感染治疗提供新途径。

1 材料与方法

1.1 材料肺泡上皮细胞A549（中国科学院细胞库），肺炎链球菌（美国ATCC 公司），蟛蜞菊内酯（成都普菲德生物技术有限公司），RPMI-1640 培养基（武汉益普生物科技有限公司），PCR 试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司；KG204］，IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒（上海瑶韵生物科技有限公司）。本研究经我院医学伦理委员会批准（编号：2022-012）。

1.2 方法

1.2.1 细胞处理与分组肺泡上皮细胞A549 置于RPMI-1640 培养基（100 U/L 青霉素、100 mg/L 链霉素的双抗及10%胎牛血清）中，培养箱（37 ℃、5% CO2）中传代培养，细胞密度至80% ～ 90%时进行传代，取3 - 5 代细胞进行后续实验。取对数生长期A549 细胞，将蟛蜞菊内酯在75 ℃下减压干燥、称重，得到Z1、Z2、Z3、Z4 四个子部，TUNEL 法检测结果显示，蟛蜞菊内酯对肺泡上皮细胞A549凋亡有不同程度的抑制作用，抑制率随浓度的增加而增加，呈剂量依赖，作用24 h 后，子部位Z2 的半抑制浓度＞ 100 μmol/L，子部位中Z2、Z3、Z4 的半抑制浓度分别为10、20、40 μmol/L，初筛结果表明，4 个子部位中Z2、Z3、Z4 对肺泡上皮细胞A549凋亡的抑制作用更为明显，后将其分为感染组（1 × 108/CFU/mL 的肺炎链球菌培养细胞）、对照组（不作处理）、感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组（10、20、40 μmol/L 蟛蜞菊内酯预处理，之后采用1 × 108/CFU/mL 的肺炎链球菌培养细胞）。

1.2.2 细胞凋亡率检测细胞凋亡情况通过TUNEL法进行测定，将所培养细胞做洗涤、DAPI 染色封片后的细胞核分别呈现为蓝色荧光（阴性细胞数）、绿色荧光（阳性细胞数），之后细胞凋亡情况采用荧光显微镜进行观察，细胞凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。试验重复测量3 次。

1.2.3 凋亡蛋白表达量检测通过Western blot（WB）对Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白相对表达量进行检测，取细胞上清液，凝胶缓冲液中加入蛋白50 μg，加热变性。待凝胶电泳后转膜，取模，在4 ℃的环境下进行1 h封闭处理，加入之后分别加入1∶1 000 TBST 给予稀释的Bax、Bcl-2、Caspase-3 一抗，4 ℃孵育过夜保存，使用0.05% ～ 0.1% Tris-HCl缓冲盐溶液+Tween去污剂进行洗膜，使用1∶10 000的二抗在室温下孵育1 h后TBST洗膜，二氨基联苯胺显色，使用Labwork 凝胶图像扫描所获得胶片，以β-actin 为内参，计算Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达量。

1.2.4 炎症因子mRNA 相对表达量检测IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相对表达量通过实时荧光定量法进行检测，取细胞上清液，提取细胞总RNA，之后逆转录为cDNA，采用Primer 5.0软件设计引物序列，启动PCR 仪。IL-6、IL-1β、TNF-α 的mRNA表达量通过2-△△Ct方法计算获得。

1.2.5 炎症因子水平检测IL-6、IL-1β、TNF-α 水平采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法进行测定，取细胞上清液，单抗包被于酶标板上，4 ℃过夜，第2 天采用洗涤缓冲液清洗，共3 次，5 min/次，加入酶标二抗37 ℃ 1 h，采用洗涤缓冲液清洗，共3 次，5 min/次，之后进行显色，避光孵育30 min，加入终止液，在450 nm 波长下检测OD值。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0 统计软件进行分析处理。计量资料采用均数±标准差描述，多组间比较采用F检验，两组间比较采用独立样本t检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞凋亡情况对比与对照组相比，感染组、感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率较高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染组相比，感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染+蟛蜞菊内酯低剂量组相比，感染+蟛蜞菊内酯中剂量组、高剂量组凋亡率较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染+蟛蜞菊内酯中剂量组相比，感染+蟛蜞菊内酯高剂量组凋亡率较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表1、图1。

图1 细胞凋亡情况对比（Tunel 染色，×200）Fig.1 Comparison of apoptosis among the three groups （Tunel staining，×200）

表1 各组细胞凋亡情况对比（n = 9）Tab.1 Comparison of apoptosis in each group （n = 9）±s，%

表1 各组细胞凋亡情况对比（n = 9）Tab.1 Comparison of apoptosis in each group （n = 9）±s，%

注：与对照组相比，aP ＜ 0.05；与感染组相比，bP ＜ 0.05；与感染+蟛蜞菊内酯低剂量组相比，cP ＜ 0.05；与感染+蟛蜞菊内酯中剂量组相比，dP ＜ 0.05

组别对照组感染组感染+蟛蜞菊内酯低剂量组感染+蟛蜞菊内酯中剂量组感染+蟛蜞菊内酯高剂量组F值P值凋亡率5.86 ± 0.42 32.38 ± 2.90a 23.96 ± 2.45ab 19.27 ± 2.06abc 10.37 ± 1.10abcd 11.490 0.001

2.2 各组细胞凋亡相关蛋白表达量对比与对照组相比，感染组、感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组Bax、Caspase-3 蛋白表达量较高，Bcl-2 蛋白表达量较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染组相比，感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组Bax、Caspase-3 蛋白表达量较低，Bcl-2 蛋白表达量较高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染+蟛蜞菊内酯低剂量组相比，感染+蟛蜞菊内酯中剂量组、高剂量组Bax、Caspase-3 蛋白表达量较低，Bcl-2 蛋白表达量较高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染+蟛蜞菊内酯中剂量组相比，感染+蟛蜞菊内酯高剂量组Bax、Caspase-3 蛋白表达量较低，Bcl-2 蛋白表达量较高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2、图2。

图2 细胞凋亡相关蛋白WB 图Fig.2 WB diagram of apoptosis-related protein

表2 各组细胞凋亡相关蛋白表达量对比（n = 9）Tab.2 Comparison of apoptosis-related protein expression levels in all groups （n = 9） ±s

表2 各组细胞凋亡相关蛋白表达量对比（n = 9）Tab.2 Comparison of apoptosis-related protein expression levels in all groups （n = 9） ±s

注：与对照组相比，aP ＜ 0.05；与感染组相比，bP ＜ 0.05；与感染+蟛蜞菊内酯低剂量组相比，cP ＜ 0.05；与感染+蟛蜞菊内酯中剂量组相比，dP ＜ 0.05

组别对照组感染组感染+蟛蜞菊内酯低剂量组感染+蟛蜞菊内酯中剂量组感染+蟛蜞菊内酯高剂量组F值P值Caspase-3 0.21 ± 0.03 0.82 ± 0.14a 0.71 ± 0.11ab 0.58 ± 0.06abc 0.40 ± 0.05abcd 9.775 0.001 Bax 0.29 ± 0.04 0.76 ± 0.12a 0.68 ± 0.09ab 0.60 ± 0.06abc 0.38 ± 0.05abcd 4.217 0.001 Bcl-2 0.82 ± 0.11 0.30 ± 0.06a 0.41 ± 0.07ab 0.52 ± 0.09abc 0.70 ± 0.10abcd 2.422 0.028

2.3 各组细胞炎症因子mRNA 相对表达量与对照组相比，感染组、感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相对表达量较高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染组相比，感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相对表达量较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染+蟛蜞菊内酯低剂量组相比，感染+蟛蜞菊内酯中剂量组、高剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相对表达量较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染+蟛蜞菊内酯中剂量组相比，感染+蟛蜞菊内酯高剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相对表达量较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表3。

表3 各组细胞炎症因子mRNA 相对表达量（n = 9）Tab.3 Relative mRNA expression levels of inflammatory factors in each group （n = 9） ±s

表3 各组细胞炎症因子mRNA 相对表达量（n = 9）Tab.3 Relative mRNA expression levels of inflammatory factors in each group （n = 9） ±s

注：与对照组相比，aP ＜ 0.05；与感染组相比，bP ＜ 0.05；与感染+蟛蜞菊内酯低剂量组相比，cP ＜ 0.05；与感染+蟛蜞菊内酯中剂量组相比，dP ＜ 0.05

组别对照组感染组感染+蟛蜞菊内酯低剂量组感染+蟛蜞菊内酯中剂量组感染+蟛蜞菊内酯高剂量组F值P值TNF-α 1.00 ± 0.01 2.25 ± 0.31a 1.78 ± 0.21ab 1.66 ± 0.19abc 1.30 ± 0.14abcd 6.412 0.001 IL-6 1.00 ± 0.01 2.13 ± 0.23a 1.80 ± 0.19ab 1.65 ± 0.15abc 1.23 ± 0.11abcd 6.247 0.001 IL-1β 1.00 ± 0.01 2.20 ± 0.30a 1.76 ± 0.20ab 1.63 ± 0.18abc 1.25 ± 0.12abcd 6.228 0.001

2.4 各组细胞炎症因子水平对比与对照组相比，感染组、感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α 水平较高，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染组相比，感染+蟛蜞菊内酯低剂量组、中剂量组、高剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α 水平较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染+蟛蜞菊内酯低剂量组相比，感染+蟛蜞菊内酯中剂量组、高剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α 水平较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）；与感染+蟛蜞菊内酯中剂量组相比，感染+蟛蜞菊内酯高剂量组IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA 相对表达量较低，差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表4。

表4 各组细胞炎症因子水平对比（n = 9）Tab.4 Comparison of levels of inflammatory cytokines in each group（n = 9） ±s

表4 各组细胞炎症因子水平对比（n = 9）Tab.4 Comparison of levels of inflammatory cytokines in each group（n = 9） ±s

注：与对照组相比，aP ＜ 0.05；与感染组相比，bP ＜ 0.05；与感染+蟛蜞菊内酯低剂量组相比，cP ＜ 0.05；与感染+蟛蜞菊内酯中剂量组相比，dP ＜ 0.05

TNF-α（ng/mL）9.12 ± 1.03 59.06 ± 10.37a 50.31 ± 8.06ab 41.56 ± 7.24abc 23.16 ± 3.45abcd 11.700 0.001组别对照组感染组感染+蟛蜞菊内酯低剂量组感染+蟛蜞菊内酯中剂量组感染+蟛蜞菊内酯高剂量组F值P值IL-6（pg/mL）81.26 ± 9.45 368.45 ± 50.21a 300.41 ± 42.27ab 221.39 ± 36.24abc 154.37 ± 21.76abcd 9.245 0.001 IL-1β（pg/mL）21.39 ± 3.06 80.46 ± 10.03a 62.89 ± 7.26ab 50.30 ± 5.90abc 40.27 ± 4.96abcd 9.719 0.001

3 讨论

肺泡上皮细胞对肺泡表面张力具有调节作用，且可通过合成、分泌细胞因子参与肺部炎症反应，自然界中肺炎链球菌感染广泛存在，感染后可造成肺泡上皮细胞分泌炎症因子及凋亡，进而加重了肺部炎症反应，最终推动了疾病进展［7-9］。

蟛蜞菊内酯是由蟛蜞菊、墨旱莲等植物提取获得的香豆草草醚类化合物，具有清热解毒凉血散淤、抗炎、抗免疫抑制等作用，在毒蛇咬伤、脓毒性休克、肝疾病的治疗中均有应用［10］。蟛蜞菊内酯具有易于合成、生物活性多样、生物利用度高的优点，对细胞凋亡、炎症应答具有介导作用的Caspase 具有抑制作用［11-12］。本研究发现，肺炎链球菌感染肺泡上皮细胞采用不同浓度蟛蜞菊内酯进行处理后细胞凋亡率、Bax、Caspase-3 表达量、促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α 水平下降，Bcl-2 表达量升高，且呈浓度依赖，表明蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌感染肺泡上皮细胞炎症反应、凋亡具有剂量依赖性的抑制作用，可减轻肺泡上皮细胞损伤。

有研究［13-15］发现，细胞凋亡过程中涉及死亡受体、线粒体信号通路，其中Bax/Bcl-2 作为线粒体信号通路的一种，在细胞凋亡中发挥着重要作用，Bcl-2 对细胞凋亡具有抵抗作用，而Bax 在促进细胞凋亡的同时可拮抗Bcl-2，正常情况下Bax 在细胞胞浆中以单体形式存在，当其转移至线粒体膜后结合Bcl-2，形成异二聚体，进而对细胞凋亡起到了促进作用。Caspase-3 经细胞凋亡信号刺激后被激活，进而形成了凋亡级联反应，诱导了不可逆凋亡的发生［16］。肺泡上皮细胞在肺炎链球菌感染后出现结构、功能变化，局部生理机能下降或丧失，凋亡增加，随肺泡上皮细胞凋亡的增加机体抗感染能力降低、细胞防御功能丧失，蟛蜞菊内酯对Caspase 具有抑制作用，使得细胞凋亡率下降［17-18］。本研究发现，肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞经蟛蜞菊内酯干预后Bcl-2 表达量升高，Bax、Caspase-3 表达量降低，表明蟛蜞菊内酯对肺泡上皮细胞凋亡具有抑制作用。

诱导物、炎症介质、传感器、靶细胞/组织为炎症发生的构成部分，其中IL-6、IL-1β、TNF-α 均为炎症介质，可造成组织炎症，引发或加重组织损伤［19-20］。NF-κB 途径在免疫应答、炎症反应中具有重要作用，可响应细胞外界促炎因子、病毒、辐射等刺激，释放后进入细胞核，促进IL-6、IL-1β、TNF-α 表达，而蟛蜞菊内酯对NF-κB 信号通路活化具有抑制作用，进而抑制了炎症因子表达，发挥了抗炎作用［21-22］。本研究发现，蟛蜞菊内酯可降低肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞IL-6、IL-1β、TNF-α 分泌量，提示蟛蜞菊内酯对炎症因子分泌具有抑制作用，进而减轻了组织损伤，这与黄川锋等［23］研究结果相似。

综上所述，蟛蜞菊内酯可有效抑制肺泡上皮细胞的凋亡、炎症因子分泌，为临床上治疗肺炎链球菌肺炎提供理论依据，但蟛蜞菊内酯对肺炎链球菌肺炎肺泡上皮细胞的保护机制有待进一步探讨，以此为肺炎链球菌肺炎临床治疗提供新的方法和思路。