肾透明细胞癌患者血清miR-21及miR-27b与预后的关系

陈爽 杨娜 黄禹栋 孔祥丰 李锦涛 唐以众 马克雄 张阳阳 张院冬 任承德

青海大学附属医院泌尿外科 （西宁 810000）

肾细胞癌是常见的泌尿生殖系统癌症，死亡率超过30%，根据组织学和分子亚型，透明细胞癌在肾细胞癌中的发病率最高且预后生存较差，严重威胁患者的生命安全［1-2］。近些年，随着细胞减灭性肾切除术及各类生物靶向制剂的快速发展，肾透明细胞癌的治疗选择范围越来越广，抗肿瘤效果不断提升，但现阶段死亡率仍居较高水平，因此筛查肾透明细胞癌病理相关生物学因子并及时评估病理进展及预后的关系，更有利于进一步完善肾透明细胞癌的临床诊疗方案，进而改善患者预后［3-4］。微小RNA（mircoRNA，miR）是广泛存在于病毒、人类等各类生物中的非编码调控基因，可与对应靶细胞的mRNA 结合并阻断蛋白编码基因合成，从而调控细胞增殖、分化、代谢、凋亡等生物学过程［5-6］。miR-21、miR-27b 均是癌症相关基因，目前miR-21 在结肠癌、食管癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中的病理机制已被证实［7-9］；杨旺盛等［10］、宋殿芳等［11］在研究后分别报道了miR-27b 基因在肺癌、宫颈癌中的抑癌作用；赵硕等［12］研究发现miR-27b 在肾癌患者的血清中表达量更高。然而miR-21 和miR-27b 基因表达与肾透明细胞癌病理进展、预后的相关性尚待证实。本研究筛选我院收治的118 例肾透明细胞癌患者进行前瞻性研究，初步浅析miR-21和miR-27b基因表达与肾透明细胞癌预后的相关性，为后续临床实践制定个体化治疗策略、监测治疗反应及评估预后。

1 资料与方法

1.1 一般资料筛选2019 年2 月至2021 年4 月青海大学附属医院收治的118 例肾透明细胞癌患者作为研究对象，其中女48 例，男70 例；年龄35 ～67 岁，平均（49.15 ± 4.02）岁；Fuhrman 分级：Ⅰ级36 例、Ⅱ级41 例、Ⅲ级41 例；病理分期Ⅰ期18 例、Ⅱ期30 例、Ⅲ期58 例、Ⅳ期12 例；肿瘤最大径2.51 ～ 11.04 cm，平均（5.03 ± 1.16）cm；淋巴结转移60 例，未转移58 例；其中病理分期Ⅰ期、Ⅱ期48 例患者均行细胞减灭性肾切除术切除肿瘤病灶。纳入标准：（1）符合《肾细胞癌指南》［13］中肾透明细胞癌的临床诊断，经手术或病理穿刺活检确诊；（2）年龄＞ 18 岁；（3）Fuhrman 分级Ⅰ-Ⅲ级；（4）病理分期Ⅰ-Ⅳ期；（5）Karnofsky 功能评分＞ 60 分；（6）患者签订知情同意书。排除标准：（1）合并其他肿瘤；（2）非原发病灶；（3）合并全身严重感染或多器官衰竭；（4）免疫功能缺陷；（5）肾结石；（6）妊娠、哺乳期女性；（7）精神病。另选取院内同期健康体检患者118 例作为对照组，女50 例，男68 例；年龄39 ～ 65 岁，平均（49.03 ± 3.97）岁，年龄、性别与肾透明细胞癌组患者比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。该研究通过院内医学伦理会审核。

1.2 血清miR-21 及miR-27b 检测方法采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法［14］检测所有受试者血清miR-21 及miR-27b 表达：患者入组24 h内（术前），采集受试者肘静脉血2 ～ 4 mL，加入离心机3 000 r/min 高速离心12 min 后（离心半径R = 13.5 cm），吸取上清液，待检。使用miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）试剂盒（广州健仑生物科技有限公司）提取总RNA，使用Hifair®V Reverse Transcriptase 逆转录试剂盒（上海翌圣生物科技股份有限公司）逆转录后行PCR 扩增。PCR 仪选用寰熙医疗器械有限公司ViiA 7 Dx 定量荧光PCR扩增仪。以CT 值为基础，2-△△CT法计算miR-21 及miR-27b 表达水平。miR-21 及miR-27b 以U6（正向引物：5′-CTAGCTAGATGACCTCTGCTGAC-3′， 反向引物：5′-TCAGCTATCACTGTGTATGCTCA-3′）作为内参对照，miR-21 正向引物序列：5′-CACATCACACCGTATGCAGTGAG-3′，反向引物：5′-CACTATGTCTCGTCACGTCGATC-3′；miR-27b 正向引物序列：5′-TGCATCGATTCCGATGATGCCAG-3′，反向引物：5′-GTCACTTACTGATGCTATCCGTA-3′。

1.3 评估指标（1）血清miR-21 及miR-27b 在肾透明细胞癌患者及健康对照中的表达；（2）不同病理分期、Fuhrman 分级肾透明细胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表达及相关性；（3）血清miR-21及miR-27b 表达与肾透明细胞癌患者生存预后分析。

1.4 统计学方法采用SPSS 软件v.19 进行统计学分析，以（±s）表示正态分布的计量资料，采用t检验。重复测量资料比较采用重复测量方差分析，差异有统计学意义则进行两两比较，采用SNK-q检验。计数资料以例（%）表示，采用χ2检验。采用Spearman 相关性分析法分析血清miR-21及miR-27b 表达水平与病理分期、Fuhrman 分级的相关性。Kaplan-Meier 分析与对数秩检验用于生存分析，行Log-rank χ2检验。P＜ 0.05 提示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清miR-21 及miR-27b 在肾透明细胞癌患者及健康对照中的表达肾透明细胞癌组患者的血清miR-21 及miR-27b 表达量均高于健康对照组（P＜ 0.05）。见表1。

表1 血清miR-21 及miR-27b 在肾透明细胞癌患者及健康对照中的表达分析Tab.1 Expression analysis of serum miR-21 and miR-27b in renal clear cell carcinoma patients and healthy controls x ±s

2.2 不同病理分期肾透明细胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表达及相关性

2.2.1 不同病理分期肾透明细胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表达Ⅲ期患者的血清miR-21表达量高于Ⅰ期（P＜ 0.05），Ⅳ期患者的血清miR-21 表达量高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期（P＜ 0.05）。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者的血清miR-27b 表达量逐渐升高，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表2。

表2 不同病理分期肾透明细胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表达分析Tab.2 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different pathological stages±s

表2 不同病理分期肾透明细胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表达分析Tab.2 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different pathological stages±s

注：与Ⅰ期比较，aP ＜ 0.05；与Ⅱ期比较，bP ＜ 0.05；与Ⅲ期比较，cP ＜ 0.05

血清miR-27b相对表达量2.31 ± 0.36 2.89 ± 0.39a 3.11 ± 0.41ab 5.32 ± 0.59abc 135.345 0.001病理分期Ⅰ期（n = 18）Ⅱ期（n = 30）Ⅲ期（n = 58）Ⅳ期（n = 12）F值P值血清miR-21相对表达量7.09 ± 1.31 7.81 ± 1.69 8.49 ± 1.46a 12.06 ± 2.91abc 23.502 0.001

2.2.2 病理分期与血清miR-21 及miR-27b 表达的相关性病理分期与血清miR-21 及miR-27b 表达均呈正相关（r= 0.546、0.684，P＜ 0.001）。

2.3 不同Fuhrman 分级肾透明细胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表达及相关性

2.3.1 不同Fuhrman 分级肾透明细胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表达Fuhrman 分级Ⅰ、Ⅱ级、Ⅲ级患者的血清miR-21、miR-27b 表达量逐渐升高，差异均有统计学意义（P＜ 0.05）。见表3。

表3 不同Fuhrman 分级肾透明细胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 表达分析Tab.3 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different Fuhrman grades±s

表3 不同Fuhrman 分级肾透明细胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 表达分析Tab.3 Analysis of serum miR-21 and miR-27b expression in patients with renal clear cell carcinoma of different Fuhrman grades±s

注：与Ⅰ级比较，aP ＜ 0.05；与Ⅱ级比较，bP ＜ 0.05

Fuhrman分级Ⅰ级（n = 36）Ⅱ级（n = 41）Ⅲ级（n = 41）F值P值血清miR-27b相对表达量2.64 ± 0.38 2.97 ± 0.37a 3.81 ± 0.46ab 81.198 0.001血清miR-21相对表达量7.31 ± 1.38 7.74 ± 1.50a 10.39 ± 2.51ab 31.098 0.001

2.3.2 Fuhrman 分级与血清miR-21 及miR-27b表达的相关性Fuhrman 分级与血清miR-21 及miR-27b 表达均呈正相关（r= 0.550、0.769，P＜0.001）。

2.4 血清miR-21 及miR-27b 表达与肾透明细胞癌患者生存预后分析根据患者的血清miR-21 及miR-27b 中位表达分为miR-21 高表达组（n= 59）和低表达组（n= 59），miR-27b 高表达组（n= 59）和低表达组（n= 59）。随访结束均未失访，随访时间6 ～ 24 个月，中位随访时间为18 个月，miR-21 高表达组死亡13 例，低表达组死亡4 例，两组生存曲线比较差异有统计学意义（Log-rank χ2= 5.926，P= 0.015）；miR-27b 高表达组死亡12 例，低表达组死亡5 例，两组生存曲线比较差异有统计学意义（Log-rank χ2= 3.695，P= 0.045）。见图1-2。

图1 血清miR-21 表达与肾透明细胞癌患者生存预后分析Fig.1 Analysis of serum miR-21 expression and survival prognosis in patients with renal clear cell carcinoma

图2 血清miR-27b 表达与肾透明细胞癌患者生存预后分析Fig.2 Analysis of serum miR-27b expression and survival prognosis in patients with renal clear cell carcinoma

3 讨论

肾透明细胞癌是肾细胞癌中最普遍和最具侵袭性的亚型，约占所有肾细胞癌的70%，临床上大约1/3 的肾透明细胞癌患者在初次诊断时已出现转移，而四分之一的局部疾病患者在根治性手术切除后会同样出现复发性转移，且转移后肾透明细胞癌的发生总是与高死亡率密切相关［15-17］。此外尽管抗血管生成治疗和免疫疗法显著改善了肾透明细胞癌转移患者的预后，但许多患者不可避免地会产生耐药性，因而导致治疗失败，生存预后较差［18］。因此，鉴于肾透明细胞癌的高发病率和死亡率，筛选高敏性生物学指标评估患者病理预后，进而尝试调整临床治疗干预方案，成为近些年肾透明细胞癌研究中的重要方向之一。

miR 作为内源基因编码的单链RNA 分子，具有阻断蛋白编码基因、调节缺氧和血管生成的功能，与肿瘤细胞增殖及血管新生关联密切［19］，且近几年国内研究中针对各类miR 及其上下游特定基因在消化道肿瘤、呼吸道肿瘤、泌尿系统肿瘤等领域的研究逐渐增多，针对miR 的水平检测已然相对成熟。笔者以此为切入点，选取现阶段研究中已证实在多种实体瘤中表达异常的癌症因子miR-21 及miR-27b，分析并尝试建立其与肾透明细胞癌的关联性，为临床实践中肾透明细胞癌的诊疗及预后评估提供指导。本研究结果显示，肾透明细胞癌组患者的血清miR-21 及miR-27b 表达量均高于健康对照组，提示血清miR-21 及miR-27b 在肾透明细胞癌中出现高表达，可能在肾透明细胞癌中发挥促癌作用。WOLF 等［20］在针对肾透明细胞癌的建模及治疗的研究中提出，肾透明细胞癌的特征是控制缺氧信号通路发生基因突变，导致代谢失调、血管生成增强、瘤内异质性和有害的肿瘤微环境串扰，特定基因表达的抑制或激活可能有助于攻克长期治疗失败的障碍，进而提高肾透明细胞癌患者的生存率。YAO 等［21］研究表明miR-27b 可通过抑制PPARγ 基因通路，加重缺氧诱导的下丘脑-垂体-肾上腺轴功能障碍。此外，SITU 等［22］在一项关于血管内皮生长因子与肾细胞癌的表达、预后、基因调控网络及调控靶点的研究中提出，肾细胞癌中相关靶标miR-21 的表达与肿瘤血管生成增强有关，且与CD8+T 细胞、巨噬细胞、树突状细胞及中性粒细胞的免疫细胞的浸润有关。因此，本研究分析，肾透明细胞癌患者的病理进展与miR-21 及miR-27b 表达量升高有关，与miR-27b 介导的下丘脑-垂体-肾上腺轴信号通路与miR-21 调节的肿瘤血管生成有关。

本研究预后生存分析得出，不同血清miR-21及miR-27b 水平的肾透明细胞癌患者的生存预后差异显著，可以看出血清miR-21 及miR-27b 表达量越高则总生存预后期越短，研究分析可能与血清miR-21 及miR-27b 表达促进肾透明细胞癌的增殖、迁移有关。MEN 等［23］在对磷酸赖氨酸磷酸组氨酸无机焦磷酸磷酸酶基因靶向共表达microRNA 在RCC 机制中的探究中发现，miR-21 可促进肾细胞癌增殖、上皮-间质转化、侵袭，且可能是肾透明细胞癌患者的独立预后生物学标志物。PUE 等［24］在分析舒尼替尼治疗肾透明细胞患者的治疗反应性及生存预后的报告中显示，miR-27b 表达在长期缓解者与原发性难治性患者中差异显著。因此通过对肾透明细胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 的研究，有助于进一步指导后续microRNA 的临床抗肿瘤治疗及评估预后。病理分期和Fuhrman 分级分别作为评估肾透明细胞癌病理进展及预后的客观指标，对提示患者的病情严重程度及预后具有重要的参考价值。本研究进一步对不同病理分期及Fuhrman 分级的肾透明细胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表达进行比较，结果发现随着病理分期及Fuhrman 分级的升高，患者的血清miR-21 及miR-27b 水平整体上呈升高趋势，且表现出统计学差异，研究分析肾透明细胞癌患者的血清miR-21 及miR-27b 表达可提示患者的病情进展及预后生存状况，但具体病理机制仍需后续研究中不断完善证实。

综上所述，肾透明细胞癌患者的血清miR-21及miR-27b 表达水平可反映患者的病情进展及预后生存情况。但本研究为单中心样本对照研究，纳入样本量有限，且对miR-21、miR-27b 与肾透明细胞癌病理进展的机制分析尚待深入，且后续研究中仍需完善多中心、大样本随机对照组研究，进一步证实本研究结论。