着丝粒蛋白F、miR-1-3p在中晚期胃癌患者血清中的表达及与预后的相关性

赵健 刘松杰 张观朝 沈裕厚 李凤臣 徐兵

新乡市中心医院/新乡医学院第四临床学院 1普通外科，2普瘤科 （河南新乡 453000）

胃癌，也称为胃腺癌，是全球第五大最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大原因［1］。尽管在外科手术、放化疗、靶向及免疫治疗等治疗方法方面取得了许多进展，但近年来中晚期胃癌患者的总体生存状况仍然在很大程度上不令人满意［2］。中晚期胃癌根治性切除后，近一半的患者会出现肿瘤复发［3］。远处转移和局部复发是中晚期胃癌患者死亡的主要原因［4］。因此，需要做出巨大的努力来更好地评估预后，以进行针对性治疗，改善预后状况。着丝粒蛋白F（CENPF）是一种与细胞周期相关的核抗原［5］。CENPF 将丝状体-线粒体复合体复合物关联起来，对癌症进展有影响，在各种人类恶性肿瘤中观察到高表达的CENPF，例如胃癌、前列腺癌、乳腺癌和肝细胞癌等［6］。微小核糖核酸（miRNA）通常通过介导下游靶基因来促进或抑制癌细胞进展，人类癌症中经常失调的miRNA 提示了其作为关键调节因子的功能［7］。研究表明微小核糖核酸-1-3p（miR-1-3p）的过表达抑制了细胞有氧糖酵解和胃癌细胞的增殖［8］。在前人研究中未对CENPF、miR-1-3p 在中晚期胃癌患者中表达进行探究，因此本次研究通过检测中晚期胃癌患者血清中CENPF、miR-1-3p的水平情况，探讨其与预后的相关性，以期为中晚期胃癌的预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2019 年3 月至2020 年3 月我院收治的60 例中晚期胃癌患者即为研究组（已经过病理检测确诊），男32 例，女28 例，年龄52 ～70 岁，平均（62.30 ± 6.48）岁，体质量指数（BMI）为（22.15 ± 2.36）kg/m2，按照TNM 分期来分，Ⅱb 期19 例，Ⅲ期24 例，Ⅳ期17 例，发生淋巴结转移的有18 例。同期在我院体检中心体检健康的志愿者60 例为对照组，男33 例，女27 例，年龄50 ～ 70 岁，平均（62.20 ± 6.54）岁，BMI 为（22.17 ± 2.42）kg/m2。两组一般资料比较差异无统计学意义（P＞ 0.05），有可比性，见表1。本研究经过我院医学伦理委员会审核批准（2019-136-01K），患者或家属知情并同意。纳入标准：（1）经过CT、MRI、病理学检查诊断为胃癌［9］；（2）TNM 分期为Ⅱb-Ⅳ期；（3）资料完整。排除标准：（1）患有其他恶性肿瘤的患者；（2）患有免疫性疾病的患者；（3）患有传染性疾病的患者；（4）合并心脏、肝脏、肾脏严重功能异常的患者；（5）患有精神异常的患者。

表1 一般资料比较Tab.1 Comparison of general information ±s

表1 一般资料比较Tab.1 Comparison of general information ±s

组别例数年龄（岁）BMI（kg/m2）TNM分期（例）性别（男/女，例）33/27 32/28 0.034 0.855淋巴结转移（例）对照组研究组χ2/t值P值60 60 62.20 ± 6.54 62.30 ± 6.48 0.084 0.933 22.17 ± 2.42 22.15 ± 2.36 0.046 0.964Ⅱb-19Ⅲ期-24Ⅳ期-17-18

1.2 方法

1.2.1 血清CENPF、miR-1-3p水平检测抽取所有研究组患者住院次日和志愿者体检当天的空腹静脉血10 mL，以4 500 r/min 的速度离心15 min，离心半径为20 cm，取其上清液放置于-80 ℃冰箱内待用。取所有血清样本，利用TRIzol（货号：15596-026，购自于赛默飞世尔科技有限公司）分离所有血清中的总RNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的纯度以及完整性。然后按照逆转录试剂盒（货号：K1622，购自于上海玉博生物科技有限公司）试剂盒使用说明书逆转录为cDNA。在实时荧光定量PCR 仪（型号：M381409，购自于上海艾研生物科技有限公司）上进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应。使用2×SYBR Green qPCR Master Mix （货号：A0001-R2，北京百奥创新科技有限公司）进行qPCR。20 μL 反应体系：cDNA 1 μL，上下引物（10 pmol/μL）各1 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。反应条件为95 ℃，3 min；95 ℃，20 s；58 ℃，35 s；45 个循环。使用2-ΔΔCt方法计算CENPF、miR-1-3p 表达水平。见表2。

表2 qRT-PCR 引物序列Tab.2 qRT-PCR primer sequence

1.2.2 预后对所有研究对象进行出院后3 年的随访，每3 个月进行1 次，随访截止于2023 年3 月或患者死亡。

1.3 统计学方法使用SPSS 25.0 软件对本研究数据进行处理。将符合正态分布且方差齐的计量数据用均值±标准差（±s）表示，采用独立样本t检验分析两组之间的差异；三组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间的比较采用SNK-q检验；计数资料用例表示，组间比较采用χ2检验。采用Pearson 法分析血清中CENPF、miR-1-3p 水平的相关性；采用Kaplan-Meier 法分析CENPF、miR-1-3p 表达与中晚期胃癌患者预后的关系；COX 回归分析影响中晚期胃癌患者预后的危险因素。以P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清CENPF、miR-1-3p 水平比较与对照组比较，研究组患者CENPF 水平明显升高，miR-1-3p 水平明显降低（P＜ 0.05），见表3。

表3 两组血清CENPF、miR-1-3p 水平比较Tab.3 Comparison of serum CENPF and miR-1-3p levels between the two groups ±s

表3 两组血清CENPF、miR-1-3p 水平比较Tab.3 Comparison of serum CENPF and miR-1-3p levels between the two groups ±s

组别对照组研究组t值P值例数60 60 CENPF/GAPDH 1.02 ± 0.11 1.35 ± 0.21 10.783＜ 0.001 miR-1-3p/U6 1.01 ± 0.12 0.75 ± 0.14 10.922＜ 0.001

2.2 中晚期胃癌患者血清中CENPF、miR-1-3p 水平的相关性分析通过生物信息学StarBase 网站（http：//starbase.sysu.edu.cn/）发现CENPF、miR-1-3p存在结合位点，相关性分析结果显示，中晚期胃癌患者血清中CENPF 和miR-1-3p 水平呈负相关（r=-0.650，P＜ 0.001）。见图1、图2。

图1 CENPF 与miR-1-3p 结合位点图Fig.1 Binding sites of CENPF and miR-1-3p

图2 CENPF、miR-1-3p 水平的相关性分析Fig.2 Correlation analysis of CENPF and miR-1-3p levels

2.3 不同临床病理特征下血清CENPF、miR-1-3p水平比较不同年龄、性别、BMI、肿瘤直径下CENPF、miR-1-3p 水平比较差异无统计学意义（P＞ 0.05），不同TNM 分期和淋巴结转移状况下CENPF、miR-1-3p 水平比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）。见表4。

表4 不同临床病理特征下血清CENPF、miR-1-3p 水平比较Tab.4 Comparison of serum CENPF and miR-1-3p levels under different clinicopathological characteristics±s

表4 不同临床病理特征下血清CENPF、miR-1-3p 水平比较Tab.4 Comparison of serum CENPF and miR-1-3p levels under different clinicopathological characteristics±s

注：与Ⅱb期相比，*P ＜ 0.05；与Ⅲ期相比，#P ＜ 0.05

病理特征年龄＞ 60岁≤ 60岁性别男女BMI例数CENPF t值P值miR-1-3p t值P值33 27 1.34 ± 0.22 1.36 ± 0.20 0.365 0.717 0.76 ± 0.13 0.74 ± 0.15 0.553 0.582 32 28 1.35 ± 0.22 1.36 ± 0.20 0.183 0.855 0.75 ± 0.15 0.74 ± 0.13 0.274 0.785＞ 22 kg/m2≤ 22 kg/m2肿瘤最大径＞ 4 cm＜ 4 cm TNM分期Ⅱb期Ⅲ期Ⅳ期淋巴结转移是否33 27 1.36 ± 0.21 1.34 ± 0.22 0.359 0.721 0.76 ± 0.13 0.74 ± 0.15 0.553 0.582 35 25 1.37 ± 0.21 1.33 ± 0.22 0.713 0.479 0.74 ± 0.14 0.76 ± 0.13 0.562 0.576 19 24 17 1.20 ± 0.20 1.36 ± 0.21*1.52 ± 0.22*#10.45＜ 0.001 0.87 ± 0.15 0.74 ± 0.14*0.62 ± 0.13*#14.243＜ 0.001 18 42 1.48 ± 0.20 1.30 ± 0.21 3.085 0.003 0.60 ± 0.13 0.82 ± 0.14 5.694＜ 0.001

2.4 CENPF、miR-1-3p 表达与中晚期胃癌患者预后的关系对中晚期胃癌患者进行3 年时间的随访，以中晚期胃癌患者血清CENPF、miR-1-3p 相对表达量中位数1.35、0.72 为界，CENPF ＞ 1.35 与 ≤1.35 分别为CENPF 高表达组和低表达组，miR-1-3p ＞ 0.72 与≤ 0.72 分别为miR-1-3p 高表达组和低表达组，CENPF 高表达组患者3 年生存率63.33%（19/30）显著低于低表达组93.33%（28/30）（χ2=7.954，P＜ 0.001）；miR-1-3p 高表达组患者3 年生存率96.67%（29/30）显著高于低表达组60.00%（18/30）（χ2= 11.882，P= 0.001）。见图3、4。

图3 CENPF 表达与中晚期胃癌患者预后的关系Fig.3 Relationship between CENPF expression and prognosis in patients with advanced gastric cancer

图4 miR-1-3p 表达与中晚期胃癌患者预后的关系Fig.4 Relationship between miR-1-3p expression and prognosis in patients with advanced gastric cancer

2.5 COX 回归分析影响中晚期胃癌患者预后的危险因素以中晚期胃癌患者3 年生存情况为自变量（死亡=1，存活=0），以TNM 分期（Ⅱb 期=0，III～IV 期=1）、淋巴结转移（是=1，否=0）、CENPF（高表达=1，低表达=0）、miR-1-3p（高表达=0，低表达=1）为自变量进行COX 回归分析。单因素COX分析表明，TNM 分期、淋巴结转移、CENPF、miR-1-3p 是影响中晚期胃癌患者预后的危险因素（P＜0.05）；多因素COX 回归分析显示，TNM 分期、淋巴结转移、CENPF、miR-1-3p 表达是影响中晚期胃癌患者预后的危险因素（P＜ 0.05）。见表5。

表5 COX 回归分析影响中晚期胃癌患者预后的危险因素Tab.5 COX regression analysis of risk factors affecting prognosis in patients with advanced gastric cancer

3 讨论

胃癌肿瘤起源于胃黏膜上皮，由于饮食改变、工作压力增加和幽门螺杆菌感染，胃癌的发病率呈年轻化趋势［10-11］。临床上，缺乏特殊症状是患者早期诊断的痛点，随着早期患者的诊断和治疗水平提高，其长期生存率有所提高，但中晚期胃癌患者的预后效果仍然不佳［12-13］。因此，寻找与中晚期胃癌患者预后相关的生物学标志物具有重要的意义。

研究表明，CENPF 在乳腺癌、鼻咽癌、肝癌、食管鳞状细胞癌、胃肠道间质瘤中上调，其与侵袭性肿瘤表型和低生存率有关［14］。CENPF 表达呈细胞周期依赖性，在细胞周期过程中逐渐积累，然后在G2/M 期达到峰值水平，最终在有丝分裂完成后降解，CENPF 的表达变化已被证明与各种癌症的预后相关［15］。从功能上讲，已知细胞增殖和凋亡受CENPF 影响，CENPF 过表达与转移、TNM 分期和预后不良的相关性已在膀胱癌和乳腺癌中得到证实［16-17］。CENPF 促进肿瘤增殖和转移，例如，miRNA-COUP-TFII-FOXM1-CENPF 轴的失调有助于前列腺癌的转移，下调CENPF 重塑前列腺癌并改变细胞代谢［18］。本次研究表明，与对照组比较，研究组患者CENPF 水平明显升高，表明CENPF 水平与中晚期胃癌的发生有关，CENPF 高表达组患者3 年生存率显著低于低表达组，表明CENPF 水平的上调能够影响患者的生存状况，与预后密切相关。不同TNM 分期和淋巴结转移状况下CENPF水平比较差异有统计学意义，提示CENPF 水平的变化能够监控临床病理特征情况。

在非小细胞肺癌中，miR-1-3p 水平较低，其过表达通过靶向Mpl 基因抑制肿瘤生长和血管生成［19］。在分子机制方面，LINC00242 竞争性调控miR-1-3p，从而抵消了miR-1-3p 介导的对G6PD 的抑制，表明LINC00242 通过miR-1-3p/G6PD 信号传导调节胃癌细胞有氧糖酵解和增殖［20-22］。前列腺癌研究中，miR-1-3p 表现出下调，其过表达通过靶向两个关键细胞周期基因E3F2 和PFTK5 的3′-UTR 区在体外和体内抑制细胞生长和细胞周期进程［23-24］。本次研究表明，对照组比较，研究组患者miR-1-3p 水平明显降低，提示在患者血清中miR-1-3p 低表达促进中晚期胃癌的发生。miR-1-3p 高表达组患者3 年生存率显著高于低表达组，提示miR-1-3p 水平下调与预后相关，可以作为评估预后状况的潜在生物学指标。不同TNM 分期和淋巴结转移状况下miR-1-3p 水平比较具有显著差异性，提示miR-1-3p 水平与临床病理特征相关。

在肝癌患者组织中，miRNA 可以通过靶向CENPF 来抑制肿瘤生长［25］。miR-1-3p 通过CENPF调节介导胃癌发育，低表达的miR-1-3p 与胃癌肿瘤增殖、侵袭和迁移相关［8］。相关性分析结果显示，中晚期胃癌患者血清中CENPF 和miR-1-3p 水平呈负相关，表明CENPF 和miR-1-3p 均参与中晚期胃癌的发生，miR-1-3p 可靶向调节CENPF 来参与中晚期胃癌的发生。多因素COX 回归分析显示，TNM 分期、淋巴结转移、CENPF、miR-1-3p 表达是影响中晚期胃癌患者预后的危险因素，进一步提示CENPF、miR-1-3p 水平与预后具有相关性。

综上所述，中晚期胃癌患者血清中CENPF 水平显著升高，miR-1-3p 水平显著降低，二者与预后具有相关性。但本次研究样本数量有限，后期将扩大样本数量深入探究。