基于Meta分析的黄酮类化合物对奶牛生产性能和血清免疫指标影响的研究

王琳玮 赵小博 王 靖 蒋林树

(北京农学院,奶牛营养学北京重点实验室,北京 102206)

黄酮类化合物(flavonoids,FLAs)作为一种天然植物功能组分,具有抗菌、抗炎、抗氧化、增强免疫力、改善机体健康等多种生物学特征[1-3]。在畜牧行业中,FLAs作为饲料添加剂在改善反刍动物生产性能和机体免疫的应用中具有巨大潜力[4-7]。但饲粮中添加FLAs的研究重复性较少,缺乏系统性评价。研究表明,在饲粮中添加FLAs可降低奶牛腹泻的发生率,但在改善奶牛代谢和生长性能方面却没有显著效果[8-9]。Liu等[10]研究发现,在饲粮中添加FLAs可显著提高奶牛的产奶量和乳脂率。而郭玉新[11]研究发现,FLAs虽能够提高奶牛的奶产量,但对乳蛋白率和乳脂率没有显著影响。也有研究并未观察到添加FLAs对奶牛产奶量及乳成分产生影响[12]。在FLAs对奶牛血清免疫指标的影响方面,有研究表明,提取自大豆的FLAs可以增加奶牛血清和乳汁中免疫球蛋白A(IgA)含量[13],而提取自蜂胶的FLAs则会降低奶牛血清中免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量[14]。由此可见,由于试验条件、试验动物个体差异、饲粮组成以及添加FLAs的种类、饲喂时长、添加剂量等条件差异,所得的研究结果并不一致。采用传统的文献定性分析方法很难准确地评价奶牛饲粮中添加FLAs的影响,难以揭示FLAs对奶牛生产性能及血清免疫指标的影响。

Meta分析作为一种可以对前人发表的一系列研究的原始数据进行收集、合并和统计的定量分析方法[15],在动物科学领域,尤其是动物营养学方向逐渐被接受和应用[16],但在研究天然植物饲料添加剂对反刍动物影响方面的应用较少[17]。因此,本文搜集了2000年至今国内外相关文献,旨在通过Meta分析方法,系统地评价FLAs对奶牛生产性能及血清免疫指标的影响,同时进行敏感性分析(sensitivity analysis)和亚组分析(sub-group analysis),比较FLAs的不同种类、不同饲喂时长、不同添加剂量的作用效果,以期为FLAs在奶牛生产中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 文献检索

为确保Meta分析质量、减少发表偏倚,本研究遵循Moher等[18]提出的《系统评价和Meta分析首选报告项目》,通过计算机检索从2000年1月至2023年6月发表在Web of Science、PubMed、Scopus、中国知网(CNKI)、维普(CQVIP)、万方(Wanfang)等数据库中FLAs对奶牛生产性能及血清免疫指标影响的相关文献。在数据库中的检索关键词如下:奶牛(dairy cattle or dairy cow)、黄酮(flavonoids)、大豆黄酮(daidzein)、柚皮苷(naringin)、葛根素(puerarin)、花青素(anthocyanin)、槲皮素(quercetin)[19]、生产性能(production performance)、产奶量(milk yield)、乳成分(milk component or milk composition)、免疫指标(immune indexes or immune indices)。检索策略如表1所示。

1.2 文献纳入标准

纳入标准:1)研究主题为FLAs对奶牛生产性能和血清免疫指标的影响;2)已发表的随机对照试验且试验对象均为处于泌乳期的健康荷斯坦奶牛;3)试验饲粮中不含抗生素等其他添加剂;4)研究结果中包含奶牛生产性能、血清免疫指标数据,包括试验组和对照组的样本量、平均值、标准差(standard deviation,SD)或标准误(standard error,SE)。

1.3 文献排除标准

排除标准:1)综述性研究、会议和论文摘要等非试验性文章;2)重复发表和使用同次试验数据的文章;3)处于应激或攻毒等状态下的健康状况异常的荷斯坦奶牛;4)试验结果数据不完整的研究,如缺失平均值、标准差、标准误等关键数据或通过换算仍无法得到数据的研究;5)非中文和英文文献。

1.4 文献筛选和数据提取

首先对文献进行初步筛选。通过阅读题目与摘要,剔除与纳入标准不相符的研究,随后进行全文阅读,再剔除数据不完整的研究,最后将确定纳入的研究进行数据提取。

每个研究提取的数据包括:1)第一作者姓名、文献发表时间和发表国家;2)试验动物数量;3)试验周期;4)添加FLAs的种类;5)对照组和试验组的FLAs添加剂量;6)饲粮组成;7)测定指标:奶牛产奶量、乳成分、血清免疫球蛋白含量;8)测定指标数据(试验样本量或重复次数、平均值、标准差或标准误)。

数据处理时,默认数据服从正态分布,分析方法均为参数检验。若同一研究中含有2个及以上的试验组采用不同添加剂量或不同饲喂周期,则将各试验组的信息进行合并处理[20]。若文献中未给出标准差,则通过联系文章作者以请求得到原始数据,或通过标准误、P值、t值或置信区间(confidence interval,CI)估算标准差[21]。标准差估算具体计算公式如下:

式中:SD为标准差;SE为标准误;MD为均值差;N为试验样本量或重复次数;t为t统计量的值(若已知P值和各组样本量,可通过查t界值表获得相应的t值),CI为置信区间。

亚组数据计算公式如下:

式中:SD为标准差;SD1、SD2分别为A、B 2个亚组的标准差;N1、N2分别为A、B 2个亚组的样本量;M1、M2分别为A、B 2个亚组的平均值。如果有多个亚组的数据需要合并,可以按照上述公式,将其中2个亚组的数据进行合并,再将得到的数据与第3个亚组进行合并,以此类推。

1.5 统计学方法

使用Excel 2013表格工具进行数据的录入与换算,使用Review Manager 5.4与Stata/MP 17.0软件进行Meta分析。由于不同研究间结局指标的测量方法、测量单位并不一致,所以本研究采用标准均值差(standardized mean difference,SMD)作为效应尺度指标(effect-size indices,ESI)。各效应量均以95%CI表示,将0值作为无效值。

使用P值和I2表示异质性检验的结果,当P<0.10时,表明研究存在异质性,I2可对异质性大小进行定量分析,当I2>50%时,说明异质性显著,反之则不显著,I2值越大则表明研究间的异质性越大。本研究采用随机效应模型(randomized effect model,REM)计算合并统计量,当纳入的文献少于5篇时则采用固定效应模型(fixed effect model,FEM)[22]。在合并效应量的检验(test for overall effect)中,若P≤0.05,则说明多个研究的合并统计量具有统计学意义。

分析结果用森林图进行描述,并进行敏感性分析以确定结果是否稳健,通过对结果进行亚组分析,以探究异质性来源或亚组因素与结论的相关性。如果研究个数超过10个,需进行发表偏倚分析(publication bias analysis),通过绘制漏斗图以检验纳入文献的发表偏倚[23],文献是否存在实质的偏倚与漏斗图的对称性有关。

2 结果与分析

2.1 文献检索与筛选

本研究通过阅读文献题目和摘要后从3个中文数据库(CNKI、CQVIP、Wanfang)、3个英文数据库(Web of Science、PubMed、Scopus)中共检索文献620篇,无其他来源的研究。去重后得到文献587篇,根据筛选标准进一步剔除后,对62篇文献进行全文阅读,最后共有16篇纳入Meta分析,筛选流程如图1所示。

图1 Meta分析文献筛选流程图

2.2 纳入文献的基本特征

本研究纳入的16篇文献中,有10篇中文文献和6篇英文文献,分别来自中国(13篇)、德国(2篇)、巴西(1篇)。试验研究对象均为泌乳期的健康荷斯坦奶牛,共计300头。对照组为空白组,试验组均为在基础饲粮中添加FLAs,以全混合日粮(total mixed ration,TMR)形式饲喂。16篇研究中涉及了10种不同种类的FLAs。在试验设计方法的选择上,12篇研究采用随机区组设计,4篇研究采用拉丁方设计。所纳入的结局指标有:产奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、体细胞数、IgA含量、IgG含量、IgM含量。纳入研究的基本特征如表2所示。

2.3 结局指标的Meta分析

2.3.1 添加FLAs对奶牛产奶量影响的森林图、敏感性分析及亚组分析

所纳入的16篇文献中,均报道了添加FLAs对奶牛产奶量的影响。使用Review Manager 5.4软件绘制森林图,如图2所示,结果表明,纳入的研究间存在异质性,但异质性不显著[P=0.04<0.10,自由度(df)=15,I2=43%<50%],奶牛产奶量与添加FLAs具有相关性(SMD=0.75,95%CI:0.37～1.12,P<0.000 1)。

Experimental:试验组 experimental group;Control:对照组 control group;Std. Mean Difference:标准均值差 standardized mean difference;Study or Subgroup:研究或亚组 study or subgroup;Mean:平均值;SD:标准差 standard deviation;Total:样本数 sample number;Weight:权重;IV:逆方差 inverse variance;Random:随机;95%CI:95%置信区间 95% confidence interval;Heterogeneity:异质性;df:自由度 degree of freedom;Test for overall effect:合并效应量的检验;Favours [experimental]:试验组获益;Favours [control]:对照组获益。图7、图12、图17、图22、图27、图30、图35同 the same as Fig.7, Fig.12, Fig.17, Fig.22, Fig.27, Fig.30 and Fig.35。

本研究采用逐一剔除文献的方法进行敏感性分析。使用Stata/MP 17.0软件绘制敏感性分析图,如图3所示,可知在剔除任一个研究后的合并效应量的点估计仍落在总的合并效应量95%CI内,说明本项结局指标的合并结果是稳健的。

Meta-analysis estimates, given named study is omitted:Meta分析中忽略敏感分析图命名;Lower CI Limit:置信区间下限 lower limit of confidence interval;Estimate:估计值 estimated value;Upper CI Limit:置信区间上限 upper limit of confidence interval。图8、图13、图18、图23、图28、图31、图36同 the same as Fig.8, Fig.13, Fig.18, Fig.23, Fig.28, Fig.31 and Fig.36。

为进一步探究异质性来源或亚组因素与结论的相关性,分别根据FLAs种类、饲喂时长和添加剂量作亚组分析,使用Stata/MP 17.0软件绘制亚组分析图。

对不同种类FLAs的亚组分析结果如图4所示。将纳入文献中涉及的11种FLAs按照不同种类分为3个亚组:槲皮素亚组(Quercetin亚组)、大豆黄酮亚组(Daidzein亚组)与混合物亚组(Blend亚组),将所纳入研究中的2篇研究纳入Quercetin亚组,包括芦丁、槲皮素;7篇研究纳入Daidzein亚组,包括大豆黄酮与大豆异黄酮;7篇研究纳入Blend亚组,包括沙棘黄酮、竹叶提取物、辣木叶黄酮、柑橘黄酮、绿茶提取物、苜蓿黄铜与蜂胶提取物。结果显示,Quercetin亚组I2=0,P=0.892;Blend亚组I2=38.9%,P=0.133;Daidzein亚组I2=18.0%,P=0.292,3个亚组的异质性均不显著且低于42.7%,说明FLAs的不同种类可能是异质性来源之一。结果表明,在饲粮中添加的FLAs的主效成分为大豆黄酮或槲皮素时可提高奶牛产奶量(Quercetin亚组:SMD=1.58,95%CI:0.50～2.66;Blend亚组:SMD=0.33,95%CI:-0.18～0.85;Daidzein亚组:SMD=0.98,95%CI:0.52～1.44;组间异质性:P=0.058)。

Subgroup and study:亚组和研究;Effect:影响;95%CI:95%置信区间 95% confidence interval;Weight:权重;Quercetin:槲皮素亚组 quercetin subgroup;Blend:混合物亚组 blend subgroup;Daidzein:大豆黄酮亚组 daidzein subgroup;Subgroup:亚组;Heterogeneity between groups:组间异质性;Overall:总体;DL:Dersimonian-Laird随机效应模型 Dersimonian-Laird random effect model。图9、图14、图19、图24、图32同 the same as Fig.9, Fig.14, Fig.19, Fig.24 and Fig.32。

对FLAs不同饲喂时长的亚组分析结果如图5所示。分为饲喂时长<30 d亚组和饲喂时长≥30 d亚组。结果显示,饲喂时长<30 d亚组I2=0,P=0.523;饲喂时长≥30 d亚组I2=64.8%,P=0.006。饲喂时长≥30 d亚组的异质性显著,说明FLAs的不同饲喂时长不是异质性的来源。结果表明,以不同时长饲喂奶牛FLAs都可提高奶牛的产奶量,且饲喂时长≥30 d的效果更佳(饲喂时长<30 d亚组:SMD=0.71,95%CI:0.31～1.10;饲喂时长≥30 d亚组:SMD=0.77,95%CI:0.13～1.42;组间异质性:P=0.864)。

Subgroup and study:亚组和研究;Effect:影响;95%CI:95%置信区间 95% confidence interval;Weight:权重;<30d:饲喂时长<30 d亚组 feeding time <30 d subgroup;≥30d:饲喂时长≥30 d亚组 feeding time≥30 d subgroup;Subgroup:亚组;Heterogeneity between groups:组间异质性;Overall:总体;DL:Dersimonian-Laird随机效应模型 Dersimonian-Laird random effect model。图10、图15、图20、图25、图33同 the same as Fig.10, Fig.15, Fig.20, Fig.25 and Fig.43。

对FLAs不同添加剂量的亚组分析结果如图6所示,D1、D2、D3表示同一研究中FLAs的不同添加剂量。将各研究的试验组与对照组分为添加剂量<20 mg/kg亚组、添加剂量≥20 mg/kg且<50 mg/kg亚组、添加剂量≥50 mg/kg且<100 mg/kg亚组以及添加剂量≥100 mg/kg亚组。结果显示,添加剂量<20 mg/kg亚组I2=0.3%,P=0.426;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组I2=61.4%,P=0.005;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组I2=8.3%,P=0.359;添加剂量≥100 mg/kg亚组I2=0,P=0.520。添加剂量≥20且<50mg/kg亚组的异质性显著,说明FLAs的不同添加剂量不是异质性的来源。结果表明,以不同添加剂量饲喂奶牛FLAs都可提高奶牛的产奶量,其中添加剂量在20～50 mg/kg时效果更佳(添加剂量<20 mg/kg亚组:SMD=1.03,95%CI:0.60～1.46;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组:SMD=1.04,95%CI:0.38～1.70;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组:SMD=0.60,95%CI:0.07～1.13;添加剂量≥100 mg/kg亚组:SMD=0.61,95%CI:0.27～0.94;组间异质性:P=0.344)。

Subgroup and study:亚组和研究;Effect:影响;95%CI:95%置信区间 95% confidence interval;Weight:权重;<20:添加剂量<20 mg/kg亚组 adding does <20 mg/kg subgroup;≥20,<50:添加剂量≥20 mg/kg且<50 mg/kg亚组 adding does ≥20 mg/kg and <50 mg/kg subgroup;≥50,<100:添加剂量≥50 mg/kg且<100 mg/kg亚组 adding does ≥50 mg/kg and <100 mg/kg subgroup;≥100:添加剂量≥100 mg/kg亚组 adding does ≥100 mg/kg subgroup;Heterogeneity between groups:组间异质性;Overall:总体;DL:Dersimonian-Laird随机效应模型 Dersimonian-Laird random effect model;D1、D2、D3表示同一研究中FLAs的不同添加剂量 D1, D2 and D3 represent different adding does of FLAs in the same study。图11、图16、图21、图26、图29、图34、图37同 the same as Fig.11, Fig.16, Fig.21, Fig.26, Fig.29, Fig.34, Fig.37。

2.3.2 添加FLAs对奶牛乳脂率影响的森林图、敏感性分析及亚组分析

所纳入的16篇文献中,有15篇报道了添加FLAs对奶牛乳脂率的影响。如图7所示,结果表明,纳入的研究间存在异质性且异质性显著(P<0.000 1,df=14,I2=78%>50%),添加FLAs的奶牛的乳脂率与对照组无显著差异(SMD=-0.27,95%CI:-0.87～0.34,P=0.390 0)。

图7 FLAs对奶牛乳脂率影响的森林图

采用逐一剔除文献的方法进行敏感性分析。如图8所示,可知在剔除任一个研究后的合并效应量的点估计仍落在总的合并效应量95%CI内,说明本项结局指标的合并结果是稳健的。

图8 FLAs对奶牛乳脂率影响的敏感性分析图

对不同种类FLAs的亚组分析结果如图9所示。结果显示,Quercetin亚组I2=65.7%,P=0.088;Blend亚组I2=72.2%,P=0.003;Daidzein亚组I2=84.7%,P<0.001。3个亚组的异质性均显著,说明FLAs种类不是异质性的来源,且饲喂FLAs的种类对奶牛乳脂率的影响无统计学意义(Quercetin亚组:SMD=-1.05,95%CI:-2.84～0.74;Blend亚组:SMD=-0.06,95%CI:-0.86～0.73;Daidzein亚组:SMD=-0.29,95%CI:-1.37～0.79,组间异质性:P<0.001)。

图9 FLAs的不同种类对奶牛乳脂率影响的亚组分析图

对FLAs不同饲喂时长的亚组分析结果如图10所示。结果显示,饲喂时长<30 d亚组I2=75.3%,P<0.001;饲喂时长≥30 d亚组I2=80.1%,P<0.001。2个亚组的异质性均显著,说明在饲喂FLAs情况下,不同饲喂时长不是异质性的来源,且以饲喂FLAs的时长对奶牛乳脂率的影响无统计学意义(饲喂时长<30 d亚组:SMD=-0.01,95%CI:-0.87～0.85;饲喂时长≥30 d亚组:SMD=-0.49,95%CI:-1.36～0.39,组间异质性:P<0.001)。

图10 FLAs的不同饲喂时长对奶牛乳脂率影响的亚组分析图

对FLAs不同添加剂量的亚组分析结果如图11所示。结果显示,添加剂量<20 mg/kg亚组I2=74.2%,P=0.001;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组I2=54.4%,P=0.020;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组I2=0,P=0.465;添加剂量≥100 mg/kg亚组I2=69.9%,P=0.001。3个亚组的异质性显著,说明FLAs的不同添加剂量不是异质性的来源,且FLAs的添加剂量对奶牛乳脂率的影响无统计学意义(添加剂量<20 mg/kg亚组:SMD=-0.60,95%CI:-1.50～0.29;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组:SMD=-0.54,95%CI:-1.09～0.01;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组:SMD=-0.30,95%CI:-0.79～0.19;添加剂量≥100 mg/kg亚组:SMD=0.50,95%CI:-0.14～1.14,组间异质性:P<0.001)。

图11 FLAs的不同添加剂量对奶牛乳脂率影响的亚组分析图

2.3.3 添加FLAs对奶牛乳蛋白率影响的森林图、敏感性分析及亚组分析

所纳入的16篇文献中,有15篇报道了添加FLAs对奶牛乳蛋白率的影响。如图12所示,结果表明,纳入的研究间存在异质性,但异质性不显著(P=0.06<0.10,df=14,I2=39%<50%),奶牛乳蛋白率与添加FLAs具有相关性(SMD=0.69,95%CI:0.33～1.06,P=0.000 2)。

图12 FLAs对奶牛乳蛋白率影响的森林图

采用逐一剔除文献的方法进行敏感性分析。如图13所示,可知在剔除任一个研究后的合并效应量的点估计仍落在总的合并效应量95%CI内,说明本项结局指标的合并结果是稳健的。

图13 FLAs对奶牛乳蛋白率影响的敏感性分析图

对不同种类FLAs的亚组分析结果如图14所示。结果显示,Quercetin亚组I2=0,P=0.370;Blend亚组I2=60.7%,P=0.026;Daidzein亚组I2=8.4%,P=0.364。Blend亚组的异质性显著,说明FLAs的不同种类不是异质性的来源。结果表明,当添加的FLAs的主效成分为大豆黄酮或槲皮素时可以提高奶牛乳蛋白率(Quercetin亚组:SMD=1.19,95%CI:0.17～2.20;Blend亚组:SMD=0.49,95%CI:-0.22～1.19;Daidzein亚组:SMD=0.79,95%CI:0.37～1.20,组间异质性:P=0.529)。

图14 FLAs的不同种类对奶牛乳蛋白率影响的亚组分析图

对FLAs不同饲喂时长的亚组分析结果如图15所示。结果显示,饲喂时长<30 d亚组I2=40.5%,P=0.121;饲喂时长≥30 d亚组I2=45.5%,P=0.076。2个亚组的异质性均不显著,但大于39.2%,说明FLAs的不同饲喂时长不是异质性的来源。结果表明,以不同时长饲喂奶牛FLAs都可提高奶牛的乳蛋白率,且饲喂时长≥30 d的效果更佳(饲喂时长<30 d亚组:SMD=0.69,95%CI:0.12～1.27;饲喂时长≥30 d亚组:SMD=0.70,95%CI:0.19～1.21,组间异质性:P=0.991)。

对FLAs不同添加剂量的亚组分析结果如图16所示。结果显示,添加剂量<20 mg/kg亚组I2=0,P=0.701;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组I2=72.8%,P<0.001;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组I2=78.4%,P=0.001;添加剂量≥100 mg/kg亚组I2=59.6%,P=0.011。3个亚组的异质性显著,说明FLAs的不同添加剂量不是异质性的来源。结果表明,当FLAs的添加剂量在20～50 mg/kg时可以提高奶牛乳蛋白率(添加剂量<20 mg/kg亚组:SMD=0.18,95%CI:-0.22～0.59;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组:SMD=0.99,95%CI:0.19～1.79;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组:SMD=0.95,95%CI:-0.38～2.27;添加剂量≥100 mg/kg亚组:SMD=0.40,95%CI:-0.16～0.96,组间异质性:P=0.278)。

图16 FLAs的不同添加剂量对奶牛乳蛋白率影响的亚组分析图

2.3.4 添加FLAs对奶牛乳糖率影响的森林图、敏感性分析及亚组分析

所纳入的16篇文献中,有9篇报道了添加FLAs对奶牛乳糖率的影响。如图17所示,结果表明,纳入的研究间存在异质性且异质性显著(P=0.002<0.10,df=8,I2=67%>50%),添加FLAs的奶牛的乳糖率与对照组无显著差异(SMD=-0.08,95%CI:-0.71～0.55,P=0.80)。

图17 FLAs对奶牛乳糖率影响的森林图

采用逐一剔除文献的方法进行敏感性分析。如图18所示,可知在剔除任一个研究后的合并效应量的点估计仍落在总的合并效应量95%CI内,说明本项结局指标的合并结果是稳健的。

图18 FLAs对奶牛乳糖率影响的敏感性分析图

对不同种类FLAs的亚组分析结果如图19所示。结果显示,Quercetin亚组I2=0,P=0.620;Blend亚组I2=75.3%,P=0.001,Blend亚组的异质性显著,说明FLAs种类不是异质性的来源,且饲喂FLAs的种类对奶牛乳糖率的影响无统计学意义(Quercetin亚组:SMD=-0.58,95%CI:-1.49～0.34;Blend亚组:SMD=0.26,95%CI:-0.61～1.14,组间异质性:P=0.158)。

图19 FLAs的不同种类对奶牛乳糖率影响的亚组分析图

对FLAs不同饲喂时长的亚组分析结果如图20所示。结果显示,饲喂时长<30 d亚组I2=64.4%,P=0.038;饲喂时长≥30d亚组I2=55.4%,P=0.062。2个亚组的异质性均显著,说明FLAs的不同饲喂时长不是异质性的来源,且饲喂FLAs的时长对奶牛乳糖率的影响无统计学意义(饲喂时长<30 d亚组:SMD=0.42,95%CI:-0.58～1.42;饲喂时长≥30 d亚组:SMD=-0.49,95%CI:-1.19～0.20,组间异质性:P=0.140)。

图20 FLAs的不同饲喂时长对奶牛乳糖率影响的亚组分析图

对FLAs不同添加剂量的亚组分析结果如图21所示。结果显示,添加剂量<20 mg/kg亚组I2=86.9%,P<0.001;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组I2=0,P=0.393;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组I2=49.4%,P=0.115;添加剂量≥100 mg/kg亚组I2=79.3%,P<0.001。添加剂量<20 mg/kg亚组和添加剂量≥100 mg/kg亚组的异质性显著,说明FLAs的不同添加剂量不是异质性的来源,且FLAs的添加剂量对奶牛乳糖率的影响无统计学意义(添加剂量<20 mg/kg亚组:SMD=-0.26,95%CI:-2.00～1.49;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组:SMD=-0.48,95%CI:-0.97～0.01;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组:SMD=0.70,95%CI:-0.14～1.55;添加剂量≥100 mg/kg亚组:SMD=0.81,95%CI:-0.12～1.75,组间异质性:P=0.026)。

图21 FLAs的不同添加剂量对奶牛乳糖率影响的亚组分析图

2.3.5 添加FLAs对牛奶体细胞数影响的森林图、敏感性分析及亚组分析

所纳入的16篇文献中,有8篇报道了添加FLAs对牛奶体细胞数的影响。如图22所示,结果表明,纳入的研究间存在异质性且异质性显著(P=0.03<0.10,df=7,I2=54%>50%),牛奶体细胞数与添加FLAs具有相关性(SMD=-1.22,95%CI:-1.87～-0.56,P=0.000 3)。

图22 FLAs对牛奶体细胞数影响的森林图

采用逐一剔除文献的方法进行敏感性分析。如图23所示,可知在剔除任一个研究后的合并效应量的点估计仍落在总的合并效应量95%CI内,说明本项结局指标的合并结果是稳健的。

图23 FLAs对牛奶体细胞数影响的敏感性分析图

对不同种类FLAs的亚组分析结果如图24所示。结果显示,Blend亚组I2=53.2%,P=0.058;Daidzein亚组I2=0,P=0.483。Blend亚组的异质性显著,说明FLAs的不同种类不是异质性的来源。结果表明,在饲粮中添加FLAs可以降低牛奶体细胞数,且以大豆黄酮作为添加剂时的效果更佳(Blend亚组:SMD=-0.98,95%CI:-1.72～-0.23;Daidzein亚组:SMD=-1.89,95%CI:-2.77～-1.00,组间异质性:P=0.123)。

图24 FLAs的不同种类对牛奶体细胞数影响的亚组分析图

对FLAs不同饲喂时长的亚组分析结果如图25所示。结果显示,饲喂时长<30 d亚组I2=0,P=0.930;饲喂时长≥30 d亚组I2=78.9%,P=0.003。饲喂时长≥30 d亚组的异质性显著,说明FLAs的不同饲喂时长不是异质性的来源。结果表明,FLAs的饲喂时长<30 d可以降低牛奶体细胞数,但饲喂时长≥30 d对牛奶体细胞数的影响无统计学意义(饲喂时长<30 d亚组:SMD=-1.28,95%CI:-1.91～-0.65;饲喂时长≥30 d亚组:SMD=-1.30,95%CI:-2.65～0.05,组间异质性:P=0.978)。

图25 FLAs的不同饲喂时长对牛奶体细胞数影响的亚组分析图

对FLAs不同添加剂量的亚组分析结果如图26所示。结果显示,添加剂量<20 mg/kg亚组I2=0,P=0.828;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组I2=15.1%,P=0.317;添加剂量≥50且<100mg/kg亚组I2=0,P=0.596;添加剂量≥100mg/kg亚组I2=77.6%,P<0.001。添加剂量≥100 mg/kg亚组的异质性显著,说明FLAs的不同添加剂量不是异质性的来源。结果表明,以不同添加剂量饲喂奶牛FLAs都可降低奶牛的体细胞数,其中添加剂量在20～50 mg/kg时效果更佳(添加剂量<20 mg/kg亚组:SMD=-1.51,95%CI:-2.11～-0.91;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组:SMD=-1.94,95%CI:-2.73～-1.14;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组:SMD=-1.42,95%CI:-2.06～-0.78;添加剂量≥100 mg/kg亚组:SMD=-1.26,95%CI:-2.20～-0.32,组间异质性:P=0.696)。

图26 FLAs的不同添加剂量对牛奶体细胞数影响的亚组分析图

2.3.6 添加FLAs对奶牛血清中IgA含量影响的森林图、敏感性分析及亚组分析

所纳入的16篇文献中,有4篇文献报道了添加FLAs对奶牛血清中IgA含量的影响,因为报道的篇数少于5篇,不足以对FLAs的种类与饲喂时长作亚组分析,且采用固定效应模型计算合并统计量[22]。森林图如图27所示。结果表明,纳入的研究间存在异质性,但异质性不显著(P=0.21>0.10,df=3,I2=34%<50%),奶牛血清中IgA含量与添加FLAs具有相关性(SMD=0.68,95%CI:0.12～1.24)。

图27 FLAs对奶牛血清中IgA含量影响的森林图

采用逐一剔除文献的方法进行敏感性分析。如图28所示,可知在剔除任一个研究后的合并效应量的点估计仍落在总的合并效应量95%CI内,说明本项结局指标的合并结果是稳健的。

图28 FLAs对奶牛血清中IgA含量影响的敏感性分析图

对FLAs不同添加剂量的亚组分析结果如图29所示。结果显示,添加剂量<20 mg/kg亚组I2=0,P=0.818;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组I2=40.4%,P=0.195;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组I2=11.0%,P=0.325;添加剂量≥100mg/kg亚组I2=66.9%,P=0.029。添加剂量≥100 mg/kg亚组的异质性显著,说明FLAs的不同添加剂量不是异质性的来源。结果表明,当FLAs的添加剂量在50～100 mg/kg时可以提高奶牛血清中IgA含量(添加剂量<20 mg/kg亚组:SMD=0.37,95%CI:-0.26～0.99;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组:SMD=1.03,95%CI:-0.26～2.31;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组:SMD=1.73,95%CI:0.80～2.65;添加剂量≥100 mg/kg亚组:SMD=0.33,95%CI:-0.89～1.56,组间异质性:P=0.098)。

图29 FLAs的不同添加剂量对奶牛血清中IgA含量影响的亚组分析图

2.3.7 添加FLAs对奶牛血清中IgG含量影响的森林图、敏感性分析及亚组分析

所纳入的16篇文献中,有5篇文献报道了添加FLAs对奶牛血清中IgG含量的影响。如图30所示,结果表明,纳入的研究间存在异质性且异质性显著(P=0.01<0.10,df=4,I2=70%>50%),添加FLAs的奶牛血清中IgG含量与对照组无显著差异(SMD=0.71,95%CI:-0.40～1.82,P=0.21)。

图30 FLAs对奶牛血清中IgG含量影响的森林图

采用逐一剔除文献的方法进行敏感性分析。如图31所示,可知在剔除任一个研究后的合并效应量的点估计仍落在总的合并效应量95%CI内,说明本项结局指标的合并结果是稳健的。

图31 FLAs对奶牛血清中IgG含量影响的敏感性分析图

对不同种类FLAs的亚组分析结果如图32所示。结果显示,Blend亚组I2=77.5%,P=0.012;Daidzein亚组I2=0,P=0.843。Blend亚组的异质性显著,说明FLAs的不同种类不是异质性的来源。结果表明,在饲粮中添加的FLAs的主效成分为大豆黄酮时可提高奶牛血清中IgG含量(Blend亚组:SMD=0.45,95%CI:-1.30～2.19;Daidzein亚组:SMD=1.26,95%CI:0.38～2.13,组间异质性:P=0.415)。

对FLAs不同饲喂时长的亚组分析结果如图33所示。结果显示,饲喂时长<30 d亚组I2=10.1%,P=0.329;饲喂时长≥30 d亚组I2=46.2%,P=0.173。2个亚组的异质性均不显著,说明FLAs的不同饲喂时长可能是异质性的来源之一。结果表明,FLAs的饲喂时长≥30 d可以提高奶牛血清中IgG含量,但饲喂时长<30 d对IgG含量的影响无统计学意义(饲喂时长<30 d亚组:SMD=-0.17,95%CI:-0.96～0.62;饲喂时长≥30 d亚组:SMD=1.83,95%CI:0.37～3.28,组间异质性:P=0.018)。

图33 FLAs的不同饲喂时长对奶牛血清中IgG含量影响的亚组分析图

对FLAs不同添加剂量的亚组分析结果如图34所示。结果显示,添加剂量<20 mg/kg亚组I2=0,P=0.716;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组I2=44.1%,P=0.147;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组I2=78.2%,P=0.010;添加剂量≥100 mg/kg亚组I2=76.5%,P=0.005。添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组与添加剂量≥100 mg/kg亚组的异质性显著,说明FLAs的不同添加剂量不是异质性的来源。结果表明,当FLAs的添加剂量<20 mg/kg时可以提高奶牛血清中IgG含量(添加剂量<20 mg/kg亚组:SMD=1.09,95%CI:0.46～1.73;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组:SMD=0.82,95%CI:-0.21～1.85;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组:SMD=1.00,95%CI:-0.84～2.83;添加剂量≥100 mg/kg亚组:SMD=0.93,95%CI:-0.62～2.47,组间异质性:P=0.977)。

图34 FLAs的不同添加剂量对奶牛血清中IgG含量影响的亚组分析图

2.3.8 添加FLAs对奶牛血清中IgM含量影响的森林图、敏感性分析及亚组分析

所纳入的16篇文献中,有4篇文献报道了添加FLAs对奶牛血清中IgM含量的影响,因为报道的篇数少于5篇,不足以对FLAs的种类与饲喂时长作亚组分析,且采用固定效应模型计算合并统计量。如图35所示,结果表明,纳入的研究间存在异质性且异质性显著(P=0.105>0.10,df=3,I2=51%>50%),添加FLAs的奶牛血清中IgM含量与对照组无显著差异(SMD=-0.05,95%CI:-0.59～0.50,P=0.87)。

图35 FLAs对奶牛血清中IgM含量影响的森林图

采用逐一剔除文献的方法进行敏感性分析。如图36所示,可知在剔除任一个研究后的合并效应量的点估计仍落在总的合并效应量95%CI内,说明本项结局指标的合并结果是稳健的。

图36 FLAs对奶牛血清中IgM含量影响的敏感性分析图

对FLAs不同添加剂量的亚组分析结果如图37所示。结果显示,添加剂量<20 mg/kg亚组I2=0,P=1.000;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组I2=0,P=0.072;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组I2=75.3%,P=0.017;添加剂量≥100 mg/kg亚组I2=30.3%,P=0.230。添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组的异质性显著,说明FLAs的不同添加剂量不是异质性的来源,且FLAs的添加剂量对奶牛血清中IgM含量的影响无统计学意义(添加剂量<20 mg/kg亚组:SMD=0.10,95%CI:-0.52～0.72;添加剂量≥20且<50 mg/kg亚组:SMD=-0.03,95%CI:-0.78～0.71;添加剂量≥50且<100 mg/kg亚组:SMD=0.08,95%CI:-1.49～1.64;添加剂量≥100 mg/kg亚组:SMD=0.31,95%CI:-0.43～1.06)。

图37 FLAs的不同添加剂量对奶牛血清中IgM含量影响的亚组分析图

2.4 发表偏倚评价

对结局指标中的奶牛产奶量、乳脂率和乳蛋白率进行发表偏倚评估,如图38所示。评估结果显示,乳脂率的漏斗图存在一定程度的不对称性,说明乳脂率的Meta分析结果存在发表偏倚,可能是由于纳入文献量较少或样本量不足导致的。产奶量与乳蛋白率的评价结果中代表研究结果的圆点较为集中,且基本对称,说明Meta分析纳入的研究同质性较好,没有观察到显著的发表偏倚,证实了研究结果的稳定性。

Funnel plot with pseudo 95% confidence limits:95%置信区间漏斗图;Effect size:效应量;Standard error of effect size:效应量的标准误差。A:产奶量 Milk yield;B:乳脂率 Milk fat rate;C:乳蛋白率 Milk protein rate。

3 讨 论

目前,在针对饲粮中添加FLAs对奶牛生产性能和血清免疫指标的研究中,受诸多相关因素影响,各研究结果并不一致。因此,本研究以健康荷斯坦奶牛为研究对象,纳入2001年以来的相关文献进行Meta分析,全面系统评价FLAs对奶牛的应用效果。

3.1 FLAs对奶牛生产性能的影响

产奶量是评定奶牛生产性能的重要指标[40]。本研究Meta分析结果表明,饲粮中添加FLAs可以有效提高奶牛产奶量。在单独观测不同的FLAs种类、饲喂时长与添加剂量方面,亚组分析结果表明,FLAs主效成分为大豆黄酮、饲喂时长≥30 d、添加剂量在20～50 mg/kg的单个亚组对产奶量的提高效果优于其他分组。沈菲[25]研究发现,补饲30 mg/kg的大豆异黄酮60 d,能够使奶牛日平均产奶量提高20.77%,而占今舜等[41]分别饲喂40 mg/kg与200 mg/kg苜蓿黄酮24 d,产奶量分别提高了7.96%与6.49%,均低于20.77%。近年来,FLAs对奶牛产奶量影响的研究主要围绕天然植物提取物展开,不同提取物中FLAs在不同剂量与饲喂时长下对产奶量影响的效果也不同,本研究在宏观层面对海量的数据进行统计,但并不代表着优势亚组的条件是绝对适用的,需要在FLAs的结构、有效含量、主效成分、生物利用度、生物适用性等方面多重考虑。例如在饲粮中补充黄岑提取物能够使奶牛的全周期泌乳量提高约13%[42],而在饲粮中补充柑橘提取物则对产奶量无显著影响[12]。而且在饲喂时长≥30 d的情况下,Gessner等[36]的研究异质性较大,可能是添加FLAs的有效成分较低导致的,这也证明了以上结论。所以,对天然植物提取物成分进行深度挖掘、完善植物中FLAs的成分检测,是未来反刍动物饲粮添加剂的研发过程中的一个重要方向。

乳脂率、乳蛋白率与乳糖率是衡量牛奶品质高低的重要指标[43-45],FLAs对乳品质的改善能力在不同的指标中也存在差异。研究对乳脂率的亚组分析结果表明,饲粮中添加的FLAs种类与饲喂时长对奶牛乳脂率无显著影响,当FLAs添加剂量≥100 mg/kg时,奶牛乳脂率有升高趋势。张一涵等[24]研究发现,在荷斯坦奶牛饲粮中添加160 mg/kg的沙棘黄酮后奶牛乳脂率显著升高;贾若愚等[46]研究发现,在荷斯坦奶牛饲粮中添加110 mg/kg的竹提取物会显著升高奶牛的乳脂率,以上研究结果均与本文结果一致。多数关于FLAs对奶牛乳蛋白率影响的试验结果表明,FLAs可有效提高荷斯坦奶牛乳蛋白率,例如:在饲粮中分别添加30 mg/kg的大豆异黄酮与28 mg/kg的槲皮素均可显著提高奶牛的乳蛋白率[25,39],且奶牛乳蛋白率会随着杜仲提取物的使用时间延长有增加的趋势[47],均与本研究所得结果一致。如今,乳制品行业对生产适合乳糖不耐症患者饮用的低乳糖牛奶表现出浓厚兴趣[48],关于饲料添加剂对奶牛乳糖率影响的研究也受到广泛关注。在本研究中,当剔除栗明月等[26]异质性较大的研究时,发现FLAs的不同饲喂时长可能是异质性来源之一。当FLAs的添加剂量≥50 mg/kg时乳糖率有升高趋势,郭玉新[11]在饲粮中补充60 mg/kg的王不留行提取物30 d,牛奶中乳糖含量提高了1.3%,但国内外对王不留行单独应用于畜禽饲料的研究报道很少,且其中黄酮苷的含量及作用机理也需进一步探究。

奶牛乳房炎是导致奶牛产奶量和繁殖性能下降的重要原因[49],在控制牛奶的乳脂、乳蛋白等指标的同时,更要做好对体细胞数的监控[50]。Meta分析结果表明,饲粮中添加FLAs可有效降低牛奶体细胞数。当剔除张一涵等[24]异质性较大的研究时,发现FLAs的不同饲喂时长可能是异质性来源之一。当饲喂时长≥30 d时,牛奶体细胞数有降低趋势。Liu等[51]在荷斯坦奶牛饲粮中添加大豆黄酮提高了4%标准乳产量并降低乳中体细胞数;邹阿玲等[52]研究发现,对奶牛补饲恰麻古90 d后乳中体细胞数平均值显著低于对照组,与本研究亚组分析结果一致。

3.2 FLAs对奶牛血清免疫指标的影响

特异性免疫球蛋白普遍存在于动物血液中[53],主要参与体液免疫的过程,其含量可以反映机体的免疫状态[54]。IgA主要参与对黏膜的保护作用,IgG与IgM在抵御感染的免疫应答中起着重要作用,其中IgM是抵御感染的第1道防线[55]。本研究Meta分析结果表明,饲粮中添加FLAs可以有效提高奶牛血清中IgA含量。李杰等[56]研究表明,在补饲当归提取物后奶牛血清中IgA含量显著升高,研究结果与本文结论一致。对血清中IgG含量的亚组分析结果显示,提高奶牛血清中IgG含量的最适饲喂时长为≥30 d,最适FLAs添加剂量为<50 mg/kg。研究发现,在对奶牛补饲丝兰提取物60 d后发现血清中IgG含量显著升高[57],低添加剂量的苜蓿黄酮可以提高奶牛血清中IgG含量[37],与本研究亚组分析结果一致。对血清中IgM含量的Meta分析结果显示,饲粮中添加FLAs对血清中IgM含量无显著影响。栗明月[58]研究表明,补饲竹叶提取物可显著升高奶牛血清中IgM含量;Abouzed等[59]研究表明,在奶牛饲粮中添加富含黄酮的木瓜提取物也可使血清中IgM含量增高,与Meta分析结果不一致的原因可能是可能由于本研究在对血清中IgM含量的Meta分析中所纳入文献较少,无法对添加FLAs与血清中IgM含量的相关性做出具体评价,而天然植物提取物中发挥主效作用的物质也有待进一步探究。

3.3 本研究的局限性

本研究仍存在一定的局限性:首先,本研究在分析FLAs对奶牛血清免疫指标的影响中所纳入的文献数量较少,可能会对Meta分析结果造成影响,这与目前FLAs对于奶牛的研究主要集中在产奶量及乳成分等常规指标上有关,未来还需进一步加强对血清免疫、氧化指标及乳中营养物质的研究。其次,各项研究所添加的FLAs的主效成分差异较大,可能造成某项结局指标的样本间异质性较大而导致Meta分析结果存在潜在异质性。因此,未来需要深入研究不同品种的FLAs的主效成分,并改进FLAs的质量评估方法,以确保FLAs在奶牛生产中得以有效应用。另外,研究缺少质量评估标准,无法客观验证试验结果的科学性,因此本研究也需要进一步优化文献的检索与筛选流程,拓宽数据采集途径,细化亚组因素以通过亚组分析更全面地探究异质性来源,提高亚组因素与结论的相关性,进一步验证研究结果。

4 结 论

采用Meta分析方法,可以从统计层面有效评价FLAs对奶牛生产性能及血清免疫指标的影响,为FLAs应用于奶牛生产实际奠定了坚实的理论基础。本研究结果表明,在饲粮中添加FLAs可以有效提高奶牛产奶量、乳蛋白率及血清中IgA含量,有效降低牛奶体细胞数。本研究结论为在饲粮中添加FLAs改善奶牛生产性能和血清免疫指标提供了坚实的理论基础。