CD73/NT5E在胶质母细胞瘤中的研究进展

邵将 李琳 郭岩松 孙程圆 温稀超 郑克彬 史彦芳

河北大学附属医院神经外科 （河北保定 071000）

胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，主要来源于神经胶质细胞，占恶性脑肿瘤的80%，尽管近年来对胶质瘤分子方面的研究取得了相当大的进展，但因为其侵袭性强、易复发、预后差的特点，胶质瘤患者的生存率及生存质量依然堪忧［1-2］。胶质母细胞瘤（glioblastoma， GBM）是起源于神经胶质祖细胞的高级别胶质瘤， WHO 分级为4 级，恶性程度最高。临床治疗方法为手术切除为主，辅以放化疗及电场治疗等综合治疗［3］。目前GBM 治疗方法有限且疗效欠佳，探求更有效的新疗法是很有必要的。近年来肿瘤免疫治疗相关领域正在迅速发展，尤其是免疫检查点抑制剂，如细胞T 淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyteassociated antigen-4， CTLA-4）和程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1， PD-1）/程序性死亡配体1（programmed death-ligand 1， PD-L1）是临床上最常用的免疫检查点抑制剂，其在恶性黑色素瘤和非小细胞肺癌的临床治疗中获得较好的收益。在这个免疫治疗的新时代，CD73 作为一个新兴的肿瘤免疫靶点，其与肿瘤的发生发展、转移侵袭、不良预后密切相关，现有的基础研究报道提示其拥有良好的应用前景。因此，我们首先讨论了CD73 的作用机制，然后针对CD73 在胶质瘤中的生物学作用及应用进行简要汇总，旨在进一步分析CD73 作为新的免疫靶点在胶质母细胞瘤治疗过程中的潜在意义，同时为肿瘤免疫治疗的基础研究提供新的方向。

1 CD73/NT5E 的作用机制

CD73 又称胞外5′-核苷酸酶（extracellular-5′-nucleotidase，NT5E），是一种由NT5E 基因编码的并被糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定的细胞表面蛋白。CD73 广泛表达于不同的组织和细胞类型，如淋巴细胞、内皮细胞和上皮细胞和神经胶质细胞等［4］。CD73 是腺苷三磷酸（ATP）转换过程中的重要组成部分，ATP 和腺苷之间的平衡对于防止过度炎症反应引起的组织损伤至关重要。在炎症、恶性肿瘤和缺血等应激情况下，细胞外的ATP 水平会有所升高。CD73 作为腺苷生成的限速酶，可以将ATP触发的免疫激活转化为腺苷介导的免疫抑制，将具有促炎作用的细胞外ATP 转化为具有抗炎作用的腺苷，这在维持组织稳态中起着关键作用。虽然ATP 能够通过其P2 嘌呤能受体，即P2XRs 和P2YRs 介导炎症反应，但它会在CD39和CD73的作用下迅速水解产生腺苷［5-6］。CD39通过水解ATP和ADP 产生AMP，CD73 将其转化为腺苷。腺苷作为抗炎介质，通过其四种G 蛋白偶联的腺苷受体（ARs）结合（A1R、A2AR、A2BR和A3R）下调免疫细胞功能［7］。A1R和A3R通过偶联G抑制蛋白减少环磷酸腺苷（cAMP）和腺苷酸环化酶（AC）的生成，而A2A 和A2B 受体通过偶联G 刺激蛋白增加AC 和cAMP 的生成［8］。AC 和cAMP 通过激活MAPK 和PKC 等下游通路来调控肿瘤进展［9］。CD73 与其他腺苷能分子也能够通过影响多种类型的免疫细胞（T 细胞、B 细胞、NK 细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、肥大细胞、骨髓来源的抑制性细胞等）在肿瘤微环境的建立中发挥关键作用，即诱发免疫抑制，从而促进肿瘤的发生、发展［9-10］。

1.1 T 细胞CD73 在调节性T 细胞中大量表达，并经常与CD39 共表达，在Foxp3+Treg 细胞上，CD39 与CD73 共表达产生腺苷，腺苷可刺激Treg细胞增殖，并通过A2AR 抑制效应T 细胞中核因子κB 的活化，从而减少多种促炎因子和趋化因子的释放，进一步增强Treg 细胞的免疫抑制活性， 在CD4+T 细胞和CD8+T 细胞上，CD73 来源的腺苷可以通过A2AR 和A2BR 抑制这些T 细胞的增殖和分化［9，11］，还可以减少CD8+T 细胞分泌白细胞介素-2、肿瘤坏死因子和γ 干扰素，上调淋巴细胞活化基因3（LAG-3）和程序性死亡受体-1（PD-1）等免疫检查点的表达［12］。在辅助性T17 细胞表面，CD73 与CD39 共表达生成腺苷，但该活性受到白细胞介素-6 和转化生长因子-β 的严格调控［13］，在体外生成Th17 细胞时，细胞因子IL-6 和TGF 表达CD39 和CD73，从而导致腺释放，抑制CD4+和CD8+T 效应细胞功能，导致抗癌能力的下降。

1.2 B细胞B细胞是适应性体液免疫应答系统的核心部分，通过产生抗原特异性抗体发挥作用［14］。人B 淋巴细胞中可表达CD39、CD73、A1R、A2R 和A3R，并产生腺苷。CD39/CD73 表达阳性的B 细胞中能够产生腺苷，其在调节CD4+和CD8+T 细胞的免疫应答中起关键作用［7］。人调节性B 细胞中表达高水平的CD39，它们也释放白细胞介素-10 来抑制T 细胞介导的免疫反应［15］。此外，在小鼠黑色素瘤模型中，B 细胞中的CD73 活性在肿瘤生长中发挥重要作用，用CD73 特异性抑制剂腺苷5′二磷酸处理，诱导白细胞介素-17A，并促进黑色素瘤内B 细胞的存在和IgG2b 的产生［16］。

1.3 NK 细胞自然杀伤细胞（NK）在人体内发挥免疫监测的功能，可以靶向并杀死肿瘤细胞。腺苷信号通过A2AR 调控NK 细胞的成熟和抗肿瘤免疫。细胞外腺苷与NK 细胞上表达的腺苷受体（主要是A2AR）相互作用，介导抑制信号［17］。在动物研究中，A2AR 特异性靶向NK 细胞已被证明可以延缓肿瘤的发生和抑制肿瘤的生长［18］。值得注意的是，A2AR 拮抗剂与NK 细胞治疗联合使用可促进NK 细胞介导的抗肿瘤免疫［15，19］。CD73 在NK细胞上产生的腺苷也通过A3R 激活IL-12 的活性来增强NK 细胞的细胞毒性免疫应答［20］。

1.4 巨噬细胞CD73 和CD39 在巨噬细胞上可同时表达［21］，它们的表达水平随巨噬细胞的激活状态而变化。通过Toll 受体活化巨噬细胞诱导ATP释放，ATP 被细胞表面CD39 快速水解［22-23］。巨噬细胞分为两个主要亚群，促进炎症进展的M1 群和抑制炎症进展的M2 群，与M2 亚群相比，M1 巨噬细胞表达较低水平的CD39 和CD73。在荷瘤小鼠中，降低CD73 活性会减少M2 巨噬细胞，增加M1亚群［24］。然而，CD73 的表达和酶活性在体外极化的促炎性人M（LPS+TNF）单核细胞/巨噬细胞中被诱导，外源性AMP 或CD73 抑制剂的加入对其极化没有影响［25-26］。这说明了CD73 和CD39 的活性对于肿瘤进展过程中肿瘤相关巨噬细胞功能的微调是必需的，但仍需要更多的研究来进一步证实。

1.5 骨髓来源的抑制性细胞骨髓来源的抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells， MDSCs）是一类异质的未成熟髓细胞。肿瘤患者MDSC 上CD39 和CD73 水平较高［27-28］。CD73 介导的腺苷主要通过A2BR 促进MDSC 功能。A2BR 拮抗剂抑制肿瘤浸润性MDSCs 在TME 中的积累，从而导致小鼠模型中肿瘤生长延迟［29］。在非小细胞肺癌患者中，CD39 和CD73 共表达的MDSCs 具有丰富的抑制分子特征，肿瘤来源的转化生长因子-β 通过激活mTOR-HIF-1α 通路诱导CD39/CD73 在MDSCs上的共表达［27］。二甲双胍被发现通过激活AMP激活的蛋白激酶a 来降低CD39 和CD73，从而阻断卵巢癌患者的MDSC 活性［30-31］。这些数据说明，抑制CD39/ CD73 依赖性MDSCs 可能为改善未来的癌症免疫治疗策略提供新的机会。

2 CD73/NT5E 在胶质母细胞瘤中的生物学作用

CD73 除了影响肿瘤细胞的免疫调节外，还参与肿瘤发生的多个方面，例如增殖、侵袭、血管生成和转移。它通过调节细胞的生长周期、凋亡和EGFR、β-catenin/cyclin D1、VEGF 和AKT/ERK 等信号通路来促进肿瘤细胞的增殖。在不依赖于其酶促反应的情况下，CD73 还可以促进细胞间粘附、迁移及癌细胞侵袭［29］。CD73 在大多数人实体瘤中表达水平较高。其表达和活性与肿瘤侵袭转移密切相关［10］。CD73/NT5E 在许多人类实体肿瘤中高表达，其表达水平与肿瘤新生血管形成、侵袭性、转移以及患者生存时间缩短有关［27，29］。此外，CD73/NT5E水平与肿瘤分级和定位有显著相关性。

2.1 CD73/NT5E促进胶质母细胞的增殖及侵袭在体内外实验中证实了CD73 参与GBM 肿瘤细胞的生长，GBM 可以分泌多种具有高免疫抑制活性的肿瘤源性细胞外囊泡（TDEVs），远程抑制全身免疫系统，GBM 患者分泌高水平的CD73+TDEV，T细胞吸收GBM 细胞系释放的CD73+TDEV，消除CD73+TDEV 可减少GBM 荷瘤小鼠的肿瘤增殖，在体内，外泌体合成和CD73 表达的缺陷显著抑制了GBM 荷瘤小鼠的肿瘤生长［32］。CD73 下调可以抑制胶质母细胞瘤的体外和体内生长［33-34］。在体外实验中也观察到CD73 阻断剂治疗是通过诱导细胞凋亡来削弱GBM 的生长，而不是通过抑制细胞增殖实现的［35］。因此，CD73 参与调控GBM 肿瘤细胞的生长来促进肿瘤进展。

肿瘤细胞局部浸润性生长是GBM 重要的生物学特性。CD73 的表达受抑制可以降低GBMs 的生存能力、克隆性和侵袭能力。研究结果表明，CD73通过其酶活性和下游ADO信号传导增加GBMs 的侵袭性。磷酸二酯酶抑制剂己酮茶碱抑制胶质瘤干细胞样细胞培养中ZEB1 和CD73 的表达，应用磷酸二酯酶抑制剂己酮可可碱可以有效抑制ZEB1和CD73的表达，并显著降低体外培养GSC的活力、克隆原性和侵袭性［36］。此外，CD73 表达的下调是通过减少金属蛋白酶-2 和波形蛋白的表达来减弱胶质瘤细胞的迁移和侵袭，而腺苷可以恢复其迁移和侵袭的潜能［33］。

2.2 CD73/NT5E 有利于胶质母细胞瘤的血管生成肿瘤异常血管增生是GBM 重要的恶性行为之一，在缺氧条件下，缺氧诱导因子1 转录因子的上调会增加细胞外腺苷的CD73 生成。腺苷信号通过A2A 和A2B 腺苷受体诱导血管内皮生长因子（VEGF）的释放，而VEGF 诱导内皮细胞增殖和血管生成，从而促进肿瘤生长［37］。并且GBM 可以通过A2bR 信号通路增加MMP-2 的表达以及调节其活性引起细胞外基质的重构来促进血管生成［38］。CD73 具有促血管增生的作用。

3 CD73/NT5E 在胶质母细胞瘤中的应用

在肿瘤生长、侵袭、血管生成以及免疫抑制的肿瘤微环境的形成等方面，CD73 通过酶依赖与非依赖途径参与GBM 的进展，其中CD73 通过酶依赖途径调控腺苷的生成参与肿瘤免疫抑制微环境的形成在肿瘤进展中发挥重要作用。因此，腺苷通路中的相关分子过表达于GBM 组织中，特别是作为腺苷生成的限速酶，CD73 是一个重要的免疫检查点蛋白。目前CD73 与GBM 免疫治疗的相关性研究主要集中于CD73 与免疫检查点阻断的相关性研究。免疫检查点阻断是当前肿瘤免疫治疗最有效的方法，其是基于T 细胞衰竭的负调控通路的重新激活，其中T 细胞表达的抑制性免疫检查点蛋白CTLA-4 和PD-1 是目前免疫检查点阻断疗法的明星靶点。在一项临床Ⅱ期试验中，CD73抑制剂Oleclumab 与PD-L1 抑制剂Durvalumab 联合使用将同步放化疗后无进展的Ⅲ期非小细胞肺癌患者进展或病死率降低56%，这表现了CD73 作为免疫靶点的可行性。

有研究表明，CD73 也可以作为免疫抑制靶点来治疗胶质母细胞瘤。在小鼠研究中，研究小组已经确定CD73 巨噬细胞可用于治疗癌症。对5 种不同的人类肿瘤类型的分析发现，CD73 巨噬细胞的强烈存在是胶质母细胞瘤所独有的。在随后的实验中，在抗PD-1 和抗CTLA-4 联合免疫治疗中，CD73 的缺失可以提高用抗CTLA-4 和抗PD-1 治疗的多形性胶质母细胞瘤小鼠模型的存活率［39］。而在大鼠的胶质瘤模型中，通过CD73 特异性siRNA下调CD73 的表达，使得肿瘤组织的大小减少了80%，其相较于替莫唑胺给药组减少了60%［40］。此外，研究［41］表明免疫治疗的有效性与巨噬细胞趋化和M1样极化有关。因此血液系统来源的巨噬细胞及其表达的CD73 可能在GBM 的进展中发挥重要作用，其可作为CD73 治疗的靶点而区别于传统药物需要克服血脑屏障进入颅内杀伤肿瘤细胞［42］。虽然在GBM 治疗的临床实验并未见开展，但这些结果足以让我们认为CD73 是GBM 免疫治疗的希望。

4 展望

肿瘤免疫治疗领域正在迅速发展，CD73 靶向治疗是基础新治疗方法衍生的新免疫靶点中的一个有价值的案例。CD73 作为一个新兴的肿瘤免疫靶点，与肿瘤的各种生物学活性密切相关。越来越多的证据显示CD73-腺苷途径在肿瘤进展和免疫逃逸中起着及其重要的作用。GBM 可以表达多种免疫抑制分子，其中CD73 及其所在的通路相关分子表达较多，而CD73 作为该通路关键酶之一，参与了GBM 的进展。基础研究表明靶向CD73治疗可使GBM 患者获益并与其他治疗方式具有协同或相加的疗效，尤其是在免疫治疗方面，它是一个重要的免疫调节剂。CD73 抑制与阻断其他免疫检查点或激动剂免疫疗法联合具有有效的临床前抗肿瘤活性。目前，CD73 靶向治疗在癌症患者中的明确治疗潜力仍有待发掘，但是相信随着我们不断地深入研究，CD73 作为肿瘤免疫靶点治疗的新星，在胶质瘤的治疗中得到更加广泛的应用，使众多胶质瘤患者从中受益。