环状RNA_PLEKHM3通过miR-320/KLF4轴调控宫颈癌细胞上皮间质转化

张亚男,崔 莹,王天娇,杜忠蕾

宫颈癌转移的分子机制十分复杂,其中包括多种与转移相关基因的突变和细胞的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)[1],阐明宫颈癌细胞EMT的内在分子机制对宫颈癌的治疗具有重要价值。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一种具有共价闭环的非编码RNA,不受RNA外切酶的影响,因此circRNA的表达稳定,不易被降解[2]。研究[3]表明,circRNA在宫颈细胞中可能扮演肿瘤激活因子或抑制因子。circRNA的主要机制是通过作为一种分子海绵来调控微小RNA(microRNA,miRNA)的表达和功能,其作为一种分子支架调控miRNA与靶蛋白相互作用,从而发挥其生物学效应[4]。研究[5]表明circRNA-含Pleckstrin同源结构域家族M成员3(Pleckstrin homology domain-containing family M member 3,PLEKHM3)具有抑制癌症的潜力,可以扮演抑癌基因的角色,如circRNA_PLEKHM3过表达可以起到增强姜黄素对卵巢癌细胞的抗凋亡作用以及对卵巢癌细胞恶性行为的抑制作用。但circRNA_PLEKHM3在宫颈癌中的作用尚不清楚。该研究旨在从细胞水平阐明circRNA_PLEKHM3在宫颈癌EMT中的作用机制,为宫颈癌的诊断和治疗提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器circRNA_PLEKHM3过表达载体(pcDNA3.1-circRNA_PLEKHM3,circRNA_PLEKHM3)(货号:C01001)、空载体Vector(货号:C01001)、miR-320的模拟物(miR-320 mimics)(货号:C09001)、miR-320的模拟物的阴性对照(mimics NC)(货号:C09001)、miR-320的抑制剂(miR-320 inhibitor)(货号:C09004)、miR-320的抑制剂的阴性对照(inhibitor NC)(货号:C09004),小干扰RNA(siRNA)沉默畸变样因子4(kruppel-like factor 4,KLF4)的重组质粒(si-KLF4)(货号:G04003)、si-KLF4的阴性对照(si-NC)(货号:G04003)、含circRNA_PLEKHM3野生型(circRNA_PLEKHM3-WT)或突变型(circRNA_PLEKHM3-MUT)结合位点DNA片段的重组质粒(货号:G05002)、含有KLF4 3’UTR 野生型(KLF4 3’UTR WT)或突变型(KLF4 3’UTR MUT)结合位点的DNA片段的重组质粒(货号:G05002)(上海吉玛公司)。双荧光素酶试剂盒(美国promega公司,货号:E1910)。人宫颈鳞状细胞系Hela(货号:Delf-10469)和人宫颈癌上皮细胞系CaSki(货号:Delf-10473)(美国ATCC公司),人体正常上皮细胞系HaCat(苏州北纳创联生物技术有限公司,货号:T25)。KLF4激活剂APTO-253(美国MCE公司,货号:HY-16291)。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(货号:A5669701)、杜氏改良培养基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)培养基(货号:12491015)(美国Gibco公司)。兔抗KLF4(货号:ab222235)、上皮钙黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)(货号:ab40772)、神经钙黏蛋白(neural cadherin,N-cadherin)(货号:ab245117)、波形蛋白(Vimentin)(货号:ab92547)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2(货号:ab92536)、MMP-9(货号:ab76003)、磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase,GAPDH)(货号:ab181603)的一抗及辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase,HRP)偶联的山羊抗兔IgG二抗(货号:ab205718)(英国Abcam公司)。生理盐水(saline)(货号:ST341)、结晶紫染色液(货号:C0121)、Lipofectamine ®3000转染试剂盒(货号:C0526FT)、BCA蛋白检测试剂盒(货号:P0009)、RIPA裂解缓冲液(货号:P0013B)、免疫荧光原位杂交试剂盒(货号:R0306S)、FITC标记的circRNA_PLEKHM3探针设计与合成(货号:R0306S)(上海碧云天生物科技有限公司)。异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的抗小鼠二抗(货号:ZF-0312)、FITC 标记的抗兔二抗(货号:ZB-2301)(北京中杉金桥生物技术公司)。Transwell小室(美国SigmaAldrich公司,货号:32011202)。二脒基苯基吲哚(diaminidine phenyl indole,DAPI)(北京Solaribo公司,货号:28718-90-3)。pMIR-GLO荧光素酶载体(德国Promega公司,货号:E1330)。荧光显微镜(德国蔡司公司,型号:Axio Imager A2);实时荧光定量PCR仪(型号:CFX96)、Western blot成像分析仪(美国Bio-Rad公司,型号:CFX96);(美国伯乐公司,型号:ChemiDoc)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养分组和转染 Hela、CaSki、HaCat细胞分别用含有10%FBS的DMEM培养基培养,并置于37 ℃、含有5% CO2的细胞培养箱中进行培养。CaSki细胞的分组和转染:分别将circRNA_PLEKHM3过表达载体pcDNA3.1-circRNA_PLEKHM3(circRNA_PLEKHM3组)、空载体Vector(Vector组)转染至CaSki细胞,24 h后通过qRT-PCR检测CaSki细胞PLEKHM3 mRNA表达以检测细胞过表达circRNA_PLEKHM3的效果;分别将mimics NC(mimics NC组)、miR-320 mimics(miR-320 mimics组)以及inhibitor NC(inhibitor NC组)和miR-320 inhibitor(miR-320 inhibitor组)转染至CaSki细胞,24 h后通过qRT-PCR法检测miR-320表达;此外,在转染circRNA_PLEKHM3的同时分别将mimics NC(circRNA_PLEKHM3+mimics NC组)和miR-320 mimics(circRNA_PLEKHM3+miR-320 mimics组)转染至CaSki细胞,孵育24 h。在转染circRNA_PLEKHM3的同时分别将si-NC(circRNA_PLEKHM3+si-NC组)和si-KLF4(circRNA_PLEKHM3+ si-KLF4组)转染至CaSki细胞,孵育24 h。在转染miR-320 mimics的同时分别加入aline(mimics+saline组)和APTO-253(miR-320 mimics+APTO-253组)处理CaSki细胞,孵育24 h。

1.2.2原位荧光杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)染色实验检测circRNA_PLEKHM3在Hela、HaCat和CaSki细胞中的分布 将正常培养且无处理的Hela、HaCat和细胞固定在4%多聚甲醛中,与含有circRNA_PLEKHM3探针的杂交缓冲液在37 ℃暗处杂交过夜。用DAPI染细胞核。用荧光显微镜获取图像。

1.2.3qRT-PCR检测circRNA_PLEKHM3、KLF4 mRNA和miR-320的表达 收集HaCat、Hela和CaSki细胞的总RNA,逆转录为cDNA,行PCR扩增。以GAPDH为内参,采用2-△△CT法计算circRNA_PLEKHM3、miR-320、KLF4mRNA的相对表达量。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列见表1。

表1 PCR引物序列表

1.2.4双荧光素酶报告基因实验检测miR-320和circRNA_PLEKHM3以及miR-320和KLF4的靶向关系 通过三个生物信息公共数据库,starbase(star-base.sysu.edu.cn/)、target scan(targetscan.org/vert_70/)和circBase (http://www.circbase.org/)筛选出与circRNA_PLEKHM3有可能有相互作用的miRNA;同时在癌症基因组图谱(the cancer genome atlas,TCGA)(portal.gdc.cancer.gov)和ENCORI pan-cancer (https://rnasysu.com/encori/panCancer.php)数据库中选择在宫颈癌表达前100的miRNA,取miRNA的交集,筛选出circRNA_PLEKHM3可能的下游靶标是miR-320。

为检测miR-320和circRNA_PLEKHM3的靶向调控作用,本研究合成了含有circRNA_PLEKHM3野生型(circRNA_PLEKHM3-WT)或突变型(circRNA_PLEKHM3-MUT)结合位点的DNA片段,并将其克隆到pMIR-GLO荧光素酶载体。分离重组质粒并测序。分别将mimics NC、miR-320 mimics、inhibitor NC、miR-320 inhibitor按照Lipofectamine®3000转染试剂盒的说明书使用Lipofectamine®3000与circRNA_PLEKHM3-WT/circRNA_PLEKHM3-MUT片段共转染CaSki细胞。转染4 h后,更换培养基,将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h,废弃培养基,PBS洗涤细胞3次。用双荧光素酶试剂盒检测各组的荧光素酶活性。以萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值作为荧光素酶活性。另外,本研究还合成含有KLF4 3’UTR 野生型(KLF4 3’UTR WT)和突变型(KLF4 3’UTR MUT)结合位点的DNA片段,并将其克隆到pMIR-GLO荧光素酶载体。分离重组质粒并测序。分别将mimics NC、miR-320 mimics、inhibitor NC、miR-320 inhibitor按照Lipofectamine®3000转染试剂盒的说明书与KLF4 3’UTR WT/KLF4 3’UTR MUT片段共转染CaSki细胞,以检测miR-320和KLF4的结合作用,其余方法与circRNA_PLEKHM3一致。

1.2.5Western blot实验 用RIPA裂解缓冲液从各组细胞中提取总蛋白质,采用BCA 蛋白检测试剂盒检测总蛋白浓度。SDS-PAGE分离蛋白:70 V、30 min转120 V、90 min,将蛋白条带以 300 mA 转移到 PVDF 膜上。室温下5%脱脂牛奶封闭 2 h,将膜与一抗在 4 ℃ 下孵育过夜:KLF4(1∶800)、E-cadherin(1∶1 000)、N-cadherin(1∶600)、Vimentin(1∶1 000)、MMP-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶500)、GAPDH(1∶3 000),随后将膜与HRP偶联的山羊抗兔 IgG (1∶2 000) 于室温下一起孵育 1 h。用 ECL 检测试剂显示蛋白条带,并采用 ImageJ 软件分析每个条带的灰度值。

1.2.6Transwell侵袭和迁移实验 在细胞侵袭实验中预先在上室膜(膜的孔径为8 μm)上涂基质胶,将各组的细胞(5×104个/组)悬浮在无血清培养基的Transwell上室中,下室充满20%含FBS的培养基,37 ℃下孵育48 h后,将上表面的剩余细胞去除,固定膜下表面上的细胞,然后用结晶紫染色,并在光学显微镜下计数,从而测定细胞侵袭情况。在细胞迁移实验中,上室膜不涂基质胶,其余步骤与细胞侵袭实验一致。

2 结果

2.1 circRNA_PLEKHM3在宫颈癌细胞中的定位和表达经FISH染色观察到circRNA_PLEKHM3和细胞核分别为绿色和蓝色,circRNA_PLEKHM3定位于CaSki细胞的细胞质内(图1A)。qRT-PCR检测结果显示,与HaCat细胞相比,circRNA_PLEKHM3在Hela细胞和CaSki细胞中的表达均降低,差异有统计学意义(t=16.254、21.842,均P<0.05)(图1B)。

图1 circRNA_PLEKHM3在HaCat、CaSki和Hela细胞中表达的比较

2.2 CaSki细胞中circRNA_PLEKHM3对miR-320和KLF4表达的影响以及circRNA_PLEKHM3对miR-320的靶向调控qRT-PCR检测显示,与HaCat细胞相比,在CaSki细胞中miR-320的mRNA表达上调(t= 118.589,P<0.05),而KLF4中的mRNA表达下调(t=35.549,P<0.05)。见图2A-B。CaSki细胞转染过表达circRNA_PLEKHM3的载体,与Vector组比,circRNA_PLEKHM3组的circRNA_PLEKHM3上调(t=141.362,P<0.05),miR-320的表达下调(t=23.514,P<0.05),KLF4蛋白表达上调(t=37.498,P<0.05)。见图2C-D。提示在CaSki细胞中过表达circRNA_PLEKHM3可以抑制miR-320的表达,促进KLF4蛋白的表达。双荧光素酶报告基因实验结果显示,在circRNA_PLEKHM3-WT转染的CaSki细胞中,与mimics NC组比,miR-320 mimics组的荧光素酶活性下降(t=16.558,P<0.05),与inhibitor NC组比,inhibitor组的荧光素酶活性上调(t= 21.577,P<0.05)。而在circRNA_PLEKHM3-MUT转染的CaSki细胞中,各组之间荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。见图2E。提示miR-320是circRNA_PLEKHM3的靶点,circRNA_PLEKHM3可通过靶向调控miR-320抑制miR-320的表达。

图2 CaSki细胞中circRNA_PLEKHM3对miR-320和KLF4表达的影响以及circRNA_PLEKHM3对miR-320的靶向调控

2.3miR-320靶向调控KLF4并抑制KLF4的表达用双荧光素酶报告基因实验验证miR-320是否靶向调控KLF4。结果显示,在KLF4 3’UTR-WT转染的CaSki细胞中,与mimics NC组比,miR-320 mimics组荧光素酶活性下降(t=23.063,P<0.05),与inhibitor NC组比,inhibitor组的荧光素酶活性上调(t= 17.364,P<0.05)。而在KLF4 3’UTR-MUT转染的CaSki细胞中,各组荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)。见图3A。说明miR-320能够靶向调控KLF4。此外,qRCT和Western blot检测结果显示,与mimics NC组比,miR-320 mimics组的miR-320的mRNA表达上调(t=18.639,P<0.05),KLF4的mRNA和蛋白表达下降(t=16.603、21.558,均P<0.05);与inhibitor NC组比,miR-320 inhibitor组的miR-320的mRNA表达下调(t=14.557,P<0.05),KLF4的mRNA和蛋白表达升高(t=21.512、17.611,均P<0.05)。见图3B-D。提示CaSki细胞中miR-320能够通过靶向调控KLF4并抑制KLF4的表达。

图3 miR-320靶向调控KLF4并抑制KLF4的表达

2.4 过表达circRNA_PLEKHM3抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭和EMTTranswell细胞迁移和细胞侵袭实验结果显示,与Vector组比较,circRNA_PLEKHM3组迁移细胞数和侵袭细胞数均下降(t=16.554、18.204,均P<0.05)。见图4A-C。提示过表达circRNA_PLEKHM3抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。Western blot法检测EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达,结果显示,与Vector组比较,circRNA_PLEKHM3组的E-cadherin的表达增加(t=20.714,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达均降低(t=15.603、24.880、18.562、14.069,均P<0.05)。见图4C-H。以上结果提示过表达circRNA_PLEKHM3抑制宫颈癌细胞的EMT。

图4 过表达circRNA_PLEKHM3对宫颈癌细胞迁移、侵袭和EMT标志物的影响

2.5过表达circRNA_PLEKHM3通过抑制miR-320抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭、EMTTranswell细胞迁移和细胞侵袭实验结果显示,与circRNA_PLEKHM3+mimics NC组比较,circRNA_PLEKHM3+miR-320 mimics组的迁移细胞数和侵袭细胞数均上调(t=18.602、15.266,均P<0.05)。见图5A-C。提示过表达circRNA_PLEKHM3通过抑制miR-320抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。Western blot法检测EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达,结果显示,与circRNA_PLEKHM3+mimics NC组比较,circRNA_PLEKHM3+

图5 过表达circRNA_PLEKHM3通过抑制miR-320对宫颈癌细胞迁移、侵袭和EMT标志物的影响

miR-320 mimics组的E-cadherin的表达减少(t=24.187,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达均增加(t=17.629、11.984、16.332、19.045,均P<0.05)。见图5D-I。提示过表达circRNA_PLEKHM3通过抑制miR-320抑制宫颈癌细胞的EMT。

2.6 过表达circRNA_PLEKHM3通过上调KLF4抑制宫颈癌细胞的迁移、侵袭、EMTTranswell细胞迁移和细胞侵袭实验结果显示,与circRNA_PLEKHM3+si-NC组比,circRNA_PLEKHM3+si-KLF4组的迁移细胞数和侵袭细胞数均上调(t=23.252、14.936;均P<0.05)。见图6A-C。提示过表达circRNA_PLEKHM3通过上调KLF4抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭。Western blot法检测EMT标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达,结果显示,与circRNA_PLEKHM3+si-NC组比,circRNA_PLEKHM3+si-KLF4组的E-cadherin的表达减少(t=15.423,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达均增加(t=18.409、15.663、21.087、16.052,均P<0.05)。见图6D-I。提示过表达circRNA_PLEKHM3通过上调KLF4抑制宫颈癌细胞的EMT。

图6 过表达circRNA_PLEKHM3通过上调KLF4对宫颈癌细胞迁移、侵袭和EMT标志物的影响

2.7 过表达miR-320通过抑制KLF4促进宫颈癌细胞的迁移、侵袭、EMTTranswell实验检测结果显示,与mimics NC组比,miR-320 mimics组的迁移细胞数和侵袭细胞数均上升(t=19.677、16.375,均P<0.05),与miR-320 mimics+saline组比,miR-320 mimics+APTO-253组的迁移细胞数和侵袭细胞数均下调(t=21.065、24.316,均P<0.05)。见图7A-C。提示激活KLF4可以削弱miR-320 mimics对宫颈癌细胞的迁移和侵袭的促进作用。Western blot检测结果显示,与mimics NC组比,miR-320 mimics组的E-cadherin的表达减少(t=16.394,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达均增加(t=18.662、25.213、21.809、15.364,均P<0.05);与miR-320 mimics+saline组比,miR-320 mimics+APTO-253组的E-cadherin的表达增加(t=14.801,P<0.05),N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9的表达均降低(t=25.450、18.468、16.212、22.866,均P<0.05)。见图7D-I。提示过表达miR-320通过抑制KLF4促进宫颈癌细胞的EMT。

图7 过表达miR-320通过抑制KLF4对宫颈癌细胞的迁移、侵袭、EMT的影响

3 讨论

circRNA在癌症发生和发展中的生物学作用越来越受到关注[6]。本研究表明circRNA_PLEKHM3在宫颈癌细胞中低表达,其定位于细胞质内,提示circRNA_PLEKHM3在宫颈癌的发展中可能扮演重要角色;同时发现在宫颈癌细胞中过表达circRNA_PLEKHM3可抑制宫颈癌细胞的EMT、细胞增殖、细胞侵袭和迁移,这些结果提示,宫颈癌中circRNA_PLEKHM3可能是一种关键的抑癌靶点。此外,本研究还验证了circRNA_PLEKHM3与miR-320之间的关系。过表达circRNA_PLEKHM3抑制了miR-320的表达。本实验双荧光素酶报告基因实验的数据表明,miR-320是circRNA_PLEKHM3的靶点,miR-320 mimics抑制过表达circRNA_PLEKHM3对CaSki细胞迁移、侵袭以及EMT的抑制作用。

circRNA参与调控多种细胞生物学过程[7],也与宫颈癌密切相关[8]。本研究中,circRNA_PLEKHM3在宫颈癌细胞中低表达,过表达circRNA_PLEKHM3后,宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力均下降,提示circRNA_PLEKHM3具有抑制宫颈癌细胞转移的作用。

肿瘤转移是宫颈癌预后不良的主要原因[9]。EMT是肿瘤细胞迁移和侵袭的关键步骤[9]。在EMT过程中,E-cadherin的降低会导致细胞连接被破坏,具有抑制癌细胞EMT、迁移和侵袭的作用,而N-cadherin的增加参与了EMT过程的发生,可促进细胞的迁移和侵袭[9]。E-cadherin和N-cadherin被报道[10]与恶性肿瘤和转移有关。本研究表明,过表达circRNA_PLEKHM3能够降低N-cadherin的蛋白表达并增加E-cadherin的蛋白表达,表明circRNA_PLEKHM3具有抑制宫颈癌细胞的EMT、转移和侵袭的潜力。此外,Vimentin、MMP-2和MMP-9等蛋白也是EMT过程的关键参与因子[11]。本研究结果显示,过表达circRNA_PLEKHM3抑制了Vimentin、MMP-2和MMP-9的表达,这些发现进一步证明了circRNA_PLEKHM3在宫颈癌EMT调控中的重要性。

许多cicrRNA通过调节miRNA的表达来实现其调控功能。miR-320作为促癌miRNA分子,在肿瘤组织中表达上调[5]。本研究表明miR-320是circRNA_PLEKHM3在宫颈癌细胞中的靶分子,circRNA_PLEKHM3过表达明显抑制了宫颈癌细胞中miR-320的表达,细胞迁移和侵袭实验也揭示了miR-320的模拟物逆转了circRNA_PLEKHM3对宫颈癌细胞迁移、侵袭、EMT的抑制作用,这就证明miR-320参与了circRNA_PLEKHM3对宫颈癌细胞恶性进展的负调控作用。近年来发表的文章[5]支持了本研究结果,如在卵巢癌细胞中circRNA_PLEKHM3与miR-9或miR-320都具有靶向调节关系,circRNA_PLEKHM3可明显抑制miR-9或miR-320的表达,当过表达miR-9或miR-320后,circRNA_PLEKHM3对卵巢癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭的调作用被逆转。

miRNA通过靶向调控基因的表达来对肿瘤细胞进行调控。之前的研究[5]显示miR-320在卵巢癌中是促癌miRNA。本研究中的结果表明miR-320的靶基因是KLF4。作为一个关键抑癌基因,KLF4在多种肿瘤中的蛋白表达缺失,过表达KLF4表现出明显的抗肿瘤特征[12]。本研究进一步观察到miR-320 mimics可以抑制KLF4的表达,而KLF4的激活剂APTO-253则抑制了miR-320 mimics对宫颈癌细胞迁移、侵袭和EMT过程中的促进作用。提示KLF4是miR-320的功能性下游靶基因。此外,本研究还证明circRNA_PLEKHM3过表达可以促进KLF4的表达,而沉默KLF4能够明显恢复细胞迁移、侵袭和EMT过程。由此可见,circRNA_PLEKHM3通过抑制miR-320的上调来抑制KLF4的表达,从而调控宫颈癌细胞的EMT过程。

综上所述,本研究结果表明circRNA_PLEKHM3在宫颈癌细胞的EMT中具有抑制作用。通过调节miR-320的表达,circRNA_PLEKHM3能够对KLF4的表达进行调控。这些发现为进一步了解和干预宫颈癌的转移和侵袭提供了重要的理论依据,也为开发新的治疗策略和靶向药物提供了潜在的方向。然而,还需要更多的研究来深入探究circRNA_PLEKHM3、miR-320和KLF4之间的调控网络,以及它们在宫颈癌发生与发展中的具体作用机制。