褪黑素通过SIRT1-BMAL1通路减轻神经病理性疼痛的机制研究

王镇池,李 锐

神经病理性疼痛(neuropathic pain,NP)是一种常见的慢性痛。临床调查及动物试验[1]均表明,机体在一个昼夜循环内对于伤害性刺激的反应不尽相同,一些与伤害性感受相关的介质表达也并非一成不变[2]。机体生理功能中的昼夜节律由内部自我维持的分子振荡器控制,称为生物钟,可影响多种生理过程[3]。褪黑素有助于调节人类的昼夜节律和其他生理功能,同时也已被证明可治疗疼痛相关疾病,在人类和动物模型的疼痛手术过程中应用[4]。

沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)失活是NP的关键因子,因此激活 SIRT1蛋白进而减轻氧化应激所导致疼痛值得深入研究。时钟蛋白(CLOCK protein,CLOCK)/脑和肌肉ARNT样蛋白1(brain and muscle ARNT-like protein 1,BMAL1)异二聚体作为生物钟的起始关键物,被调节细胞内节律性的基因所表达[5]。SIRT1能够将BMAL1去乙酰化,抑制CLOCK-BMAL1介导的时钟相关基因的转录,同时也可抑制由于氧化应激所致导神经胶质激活,最终使得NP的疼痛症状得到缓解。大部分与氧化损伤相关的酶已被证明在一天内的特定时间会达到峰值,其中抗氧化酶Gpx1[6]尤为重要。该研究旨在研究褪黑素对NP夜间加重的影响,并通过SIRT1-BMAL1通路探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 96只SPF级健康雄性C57/B6小鼠,8周龄,体质量20 g,购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司,室温22～24℃,相对湿度40%～50%,房间昼夜周期为12/12 h,适应性饲养1周,按随机数字表法分为3组:假手术组(S组)、NP组和褪黑素治疗组(melatonin,NP+M组),每组24只。将所有试验小鼠饲养至指定光照模式环境中,即12 h光照(光照期8:00—12:00)与12 h黑暗(黑暗期20:00—8:00)交替,持续至少3周;将自然时间转换为授时时间(zeitgeber time,ZT),光照起点定为ZT0,ZT12-23为黑暗期,所有黑暗期操作均在红光下进行。

1.1.2主要试剂与仪器 褪黑素(货号:HY-B0075)购自美国MCE公司;组织裂解液(货号:P0013B)、蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(货号:P1046)、BSA(货号:ST023)、Triton X-100(货号:P0096)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号:P0010)和抗荧光淬灭封片液(货号:P0131)等均购自上海碧云天生物技术有限公司;Western blot山羊抗兔二抗(货号:31460)、Western blot山羊抗鼠二抗(货号:31430)、荧光山羊抗兔二抗(货号:A-11011)、荧光山羊抗鼠二抗(货号:A11011)购自美国Thermo公司;鼠抗β-actin 抗体(货号:A2228)购自美国Sigma公司;鼠抗SIRT1 抗体(货号:ab110304)、兔抗Gpx1抗体(货号:ab108427)、兔抗小胶质细胞激活标记物离子钙结合适配器分子1(ionized calcium-binding adaptermolecule-1,iba-1)抗体(货号:ab178846)购自英国Abcam公司;兔抗BMAL1抗体(货号:14020)购自美国CST公司;兔抗脊髓神经元标志物神经元特异性核蛋白(neuron-specific nuclear protein,NeuN)抗体(货号:26975-1-AP)、兔抗星形胶质细胞标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein,GFAP)抗体(货号:16825-1-AP)购自武汉三鹰生物技术有限公司。von Frey 触痛仪(型号:NC12775)购自美国IITC公司;蛋白电泳和转移设备(型号:1658033)购自美国Bio-RAD公司;全自动化学发光图像分析仪(型号:5200)购自上海天能科技有限公司;倒置显微镜(型号:Vert.A1)购自德国蔡司公司。

1.2 方法

1.2.1NP小鼠模型的建立 参照文献[7]采用坐骨神经慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury,CCI)制备NP模型。戊巴比妥 (50 mg/kg)腹腔注射麻醉后,右侧股骨上方剃毛、消毒铺巾,股骨外侧切开 2 cm 左右的皮肤,钝性分离肌肉,暴露出右侧坐骨神经主干分离神经周围的组织后在神经主干部位,用6-0铬制羊肠线以腿部不出现抽搐为标准结扎3道,间隔1 mm。假手术组仅进行前面的几个步骤,不结扎坐骨神经。压迫止血后,用缝针和 5-0手术缝合线分别对切口部位的肌肉和皮肤进行缝合。NP+M组根据文献[8]在术后7 d开始于每日昼夜转换点(ZT12)给予腹腔注射10 mg/kg褪黑素,持续至术后14 d,其他组腹腔注射同等体积生理盐水。术后14 d于不同时间点(ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22)分别取1只小鼠脊髓备用。

1.2.2疼痛行为检测 术前1 d和术后1、3、7、10和14 d不同时间点(ZT4、ZT10、ZT16和ZT22)测定小鼠机械缩足反应阈(paw withdrawal mechanical threshold,PMWT)[9]。将小鼠置于带金属网底的有机玻璃笼内,待其适应环境30 min,等小鼠各种活动基本消失后,采用 von Frey 触痛仪的刺激针缓慢接触右侧足底,记录出现缩足反应时的压力值。重复测量 3 次,间隔大于5 min,取其平均值作为 PMWT。

1.2.3Western blot 术后14 d,在ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22时点,取小鼠L4-6 节段脊髓置于-80 ℃ 冰箱中保存。Western blot法检测SIRT1、BMAL1和Gpx1蛋白表达。将脊髓组织加入RIPA裂解液,研磨后,13 200 r/min离心15 min,取上清液测定蛋白浓度。配制 10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶,上样后电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭、TBST 洗涤后分别加入鼠抗 β-actin 抗体(1∶10 000)、鼠抗SIRT1 抗体(1∶1 000)、兔抗BMAL1抗体(1∶1 000)、兔抗GPX1抗体(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜,TBST漂洗3次,每次10 min。滴加相应的山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗 (1∶10 000),摇床上反应2 h,TBST漂洗3次,每次10 min。随后在成像系统上显出蛋白条带。ImageJ图像分析软件测定条带灰度值,以目的蛋白条带与内参条带灰度值的比值来反映目的蛋白的相对表达水平。

1.2.4免疫荧光组织化学染色 术后14 d用戊巴比妥钠麻醉动物,暴露胸腔后,经左心室进针,缓慢灌注 0.9%的生理盐水,然后迅速灌注 4%的多聚甲醛,并切下右心耳。灌注完毕后,取出脊髓 L4-6 节段,放置 4%多聚甲醛中固定2 h,于4 ℃下30%的蔗糖容液中脱水过夜。将脊髓进行冰冻切片,厚度为 10 μm。在含有 5%BSA 和0.3%Triton X-100 的 PBS 中于室温下孵育1 h,PBS 清洗3次,每次 5 min。将脊髓切片与一抗鼠抗SIRT1 抗体(1∶100)、脊髓神经元标志物兔抗NeuN抗体(1∶500)、小胶质细胞激活标记物兔抗iba-1抗体(1∶1 000)、星形胶质细胞标记物兔抗GFAP抗体(1∶500)[10]4 ℃避光孵育过夜。PBS 清洗3 次,每次 5 min,然后与各一抗偶联的山羊二抗 (1∶1 000) 室温避光孵育1 h。后续步骤在避光条件下进行,使用抗荧光淬灭封片液对细胞核进行染色,PBS 清洗3 次,每次5 min,晒干,封片。在荧光显微镜下拍片观察。

1.3 统计学处理使用SPSS 22.0软件进行统计分析,小鼠的PMWT用均数±标准差来表示,采用重复测量的方差分析来比较不同时间点之间的差异性;Western blot结果组间比较采用单因素方差分析,当差异存在方差齐时比较采用t检验,否则使用 Bonferroni法进行两两比较。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NP对小鼠PMWT的影响及昼夜变化本研究结果显示,小鼠 CCI后患爪出现不堪重负、足趾并拢现象,表示小鼠NP模型制备成功。与S组比较,NP组小鼠术后3 d ZT4时点 PMWT开始下降,且至少持续至术后第14天ZT22时点(其中术后3 d :t=5.56、6.73、7.68、7.10,术后7 d:t=7.56、5.51、7.85;、15.44,术后10 d:t=8.55、9.66、11.91、9.55,术后14 d :t=11.00、5.47、13.84、12.60,均P<0.05)。与NP组相比,NP组小鼠术后7、10、14 d ZT22时点PMWT下降(t=5.95、4.30、4.70,均P<0.05),其余各时点差异无统计学意义,表明NP组疼痛行为存在昼轻夜重现象;然而NP+M组小鼠术后7、10、14 d ZT22时点与ZT10时点相比,PMWT差异无统计学意义(均P>0.05),说明昼夜转换点给予褪黑素平衡了这种昼夜差异。见图1。

图1 S组、NP组及NP+M组各时间点小鼠的PMWT (n=12)

2.2 SIRT1相关蛋白在NP昼夜节律发挥作用以及褪黑素夜间镇痛效果与NP组ZT10时点相比,NP组小鼠术后14 d ZT22时点SIRT1、BMAL1和Gpx1均降低(t=8.608、5.459、4.476,均P<0.05);表明NP组夜间SIRT1、BMAL1和Gpx1表达低于日间。与NP组相比,NP+M组ZT14时点SIRT1(t=8.761,P<0.05)与 BMAL1(t=4.738,P<0.05)升高,而Gpx1于ZT18时点升高(t=6.95,P<0.05)。提示 NP+M组SIRT1、BMAL1和Gpx1蛋白表达水平在夜间有所改善。见图2。

图2 Western blot法检测小鼠腰段脊髓组织中SIRT1、BMAL1及Gpx1表达的比较

2.3 小胶质细胞激活在褪黑素缓解NP昼夜差异中发挥作用NP组L4-6段脊髓背角荧光免疫显示,NeuN、GFAP和iba1分别标记神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞; SIRT1在脊髓背角与小胶质细胞共表达,与神经元、星形胶质细胞没有共表达。见图3。与NP组ZT10时点相比,NP组小鼠术后14 d ZT22时点小胶质细胞激活数量降低(t=7.234,P<0.05),而NP+M组小鼠无明显差异。与NP组ZT22

图3 SIRT1蛋白在脊髓背角表达荧光图 ×200

时点相比,NP+M组小鼠术后14 d ZT22时点小胶质细胞激活数量升高(t=14.14,P<0.01)。见图4。表明小胶质细胞在褪黑素通过SIRT1-BMAL1通路减轻NP夜间加重中发挥重要作用。

图4 NP和褪黑素对小胶质细胞在小鼠腰段脊髓背角激活数量的影响

3 讨论

临床发现伤害性、神经性、中枢性和混合性疼痛状态均存在昼夜节律模式[11]。本研究在啮齿动物中建立了慢性疼痛的昼夜节律,通过机械缩爪阈值测试评估CCI手术后啮齿动物的疼痛状态,结果显示NP组小鼠休息期(啮齿动物的夜间)的疼痛阈高于活动期(啮齿动物的日间)。

SIRT1是一种NAD+依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶,具有脱乙酰基特性,可以调节抗氧化酶活性[12],也可以通过去乙酰化来控制生物钟基因(如BMAL1)的表达,从而调控生物钟的分子转录。昼夜节律的转录-翻译反馈机制中,CLOCK 在其 Lys537 残基处乙酰化BMAL1,从而允许隐花色素1(cryptochromes 1,CRY1) 的募集[6]。有研究[13]表明SIRT1是昼夜节律基因表达的调节因子,在小鼠肝细胞和成纤维细胞中以昼夜节律的方式积累,并且是几个核心时钟基因(包括Bmal1、Rorγ、Per2和Cry1)的高强度昼夜节律转录所必需的,即SIRT1表达水平的变化可以影响昼夜节律相关蛋白表达进而参与诸多病理反应。在小鼠脊髓中 SIRT1可能通过对BMAL1的去乙酰化来干扰核心时钟基因来实现NP的昼夜调节。本研究结果表明CCI引起的疼痛存在昼轻夜重的节律性变化,同时,Western blot分析结果表明,SIRT1和BMAL1在脊髓背角中的表达在昼夜之间也存在差异,说明SIRT1-BMAL1通路很有可能在NP中的昼夜节律相关调节发挥着重要作用。

NP中氧化应激也发挥着一定效应。脊髓小胶质细胞内活性氧 (reactive oxygen species,ROS)由还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2诱导产生,进而诱发疼痛超敏。谷胱甘肽 (glutathione,GSH) 是一种强大的抗氧化剂,可在硒依赖性蛋白 Gpx1催化的过程中中和 ROS,从而将 GSH 转化为谷胱甘肽二硫化物 (oxidized glutathione,GSSG) 的氧化态,通过谷胱甘肽还原酶催化 GSSG 还原为 GSH 的反应,从而中和 ROS。Gpx1受到BMAL1激活后,表达水平上升,可通过抗氧化发挥缓解NP作用。然而对于这一系列反应定位仍需进一步研究。

此外,本研究通过对脊髓背角进行SIRT1双荧光免疫标记,结果表明,在雄性CCI组小鼠的脊髓背角中,SIRT1免疫荧光的细胞没有被NeuN或GFAP双标记,相反,大多数SIRT1阳性细胞被iba-1双标记,并且NP组小鼠脊髓被激活的小胶质细胞数量在昼夜之间存在差异,提示影响NP昼夜节律紊乱的SIRT1主要定位于脊髓小胶质细胞内。

褪黑素是一种众所周知的强抗氧化剂,参与多种细胞过程,如转移、增殖和凋亡。同时有研究[14]表明,褪黑素能够通过恢复基因表达的节律模式来改变各种昼夜节律基因的水平以调节昼夜节律紊乱。因此提示褪黑素有可能通过SIRT1作用于生物钟来改善NP的昼夜紊乱。本研究在 CCI 小鼠疼痛的昼夜转换点使用褪黑素进行干预,观察到用药后小鼠痛敏昼夜紊乱行为改善以及小胶质细胞受激活状态昼夜差异性改变。

综上所述,褪黑素减轻神经病理性疼痛夜间加重,其机制可能与激活小胶质细胞进而促进SIRT1-BMAL1通路蛋白表达有关。然而,本实验仍然有很多不足,如尚未研究NP后各蛋白间相互作用情况,尚未对SIRT1干预后的疼痛影响加以分析;尚未完善褪黑素给药时间点并加以比较以及尚未在细胞层面上对于疼痛发生部位的细胞加以鉴别。