大麻二酚对创伤性脑损伤大鼠脑皮质Occludin、ZO-1表达水平及血脑屏障通透性的影响

李佳丽,曹 艳,凌腾晗,尹爱平,李恒希,李经辉,张瑞林,吴海鹰,李 坪

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是一种由于外力作用于大脑而导致的中枢神经系统疾病[1-2]。TBI的继发性损伤涉及血脑屏障(blood brain barrier,BBB)受损、水肿、炎症等复杂的级联反应,BBB主要由紧密连接的脑微血管内皮细胞、周细胞、星形胶质细胞足板和基底膜组成,在维持大脑稳态中至关重要。其完整性与紧密连接蛋白密切相关,主要包括闭合蛋白(Occludin)、密封蛋白和闭锁小带蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1),紧密连接蛋白Occludin和ZO-1被认为是判断BBB完整性的标志物[3]。BBB受损被认为是TBI高发病率和高病死率的主要危险因素之一[4-5],因此寻找药物干预TBI后BBB损伤具有重要意义。大麻二酚(cannabidiol,CBD)是天然植物大麻的主要提取物之一,具有抗氧化应激、抗炎、促进神经细胞增殖以及抑制凋亡等神经保护作用,能够改善脑损伤[6-7]。但其是否对紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达水平产生干预作用以及干预作用是否随着干预时间变化而产生变化尚不明确。因此,该研究旨在探讨CBD对TBI后紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达水平和对BBB渗透性的干预作用,从而探索TBI潜在治疗药物,以及为CBD用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SPF级SD雄性大鼠,体质量260～280 g,共72只,由实验动物中心提供。提前1周运至实验室,常规饲养(温度20～25 ℃、湿度55%～65%,给予自由饮食、饮水)。

1.1.2主要试剂和仪器 CBD粉末(云南汉素公司,货号:20200601,纯度≥99.5%)兔抗大鼠ZO-1多克隆抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司,货号:AF5145),兔抗大鼠Occludin多克隆抗体(货号:27260-1-AP),兔抗大鼠β-actin多克隆抗体(货号:20536-1-AP),HRP标记的山羊抗兔IgG二抗(货号:SA00001-2)均购自武汉三鹰生物技术有限公司,Cy3标记的山羊抗兔IgG抗体(货号:C2306),含DAPI的抗荧光衰减封片剂(货号:F6057)均购自美国sigma公司,BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司,货号:P00010),即用型免疫组化超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司,货号:KIT-9720),高灵敏化学发光检测试剂盒(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BL520A),三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA,上海易恩化学技术有限公司,货号:R050965),氢氧化钠(sodium hydroxide,NaOH,云南景锐科技有限公司,货号:K7-1),多功能酶标仪(美国Thermo Fisher公司,型号:Multiskan FC),大鼠脑立体定位仪(深圳瑞沃德生命科技有限公司,型号:68802),VICTOR NivoTM多模式微孔板检测仪(美国Perkin Elmer公司,型号:VICTOR NivoTM),光学显微镜(德国Leica公司,型号:DM4000B),凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司,型号:Chemi DocTMXRS+),荧光倒置显微镜(德国Zeiss公司,型号:Axio Observer)。

1.2 方法

1.2.1动物分组及模型制备 SD大鼠随机分为3组:假手术组(Sham组)、模型组(TBI+vehicle组)和CBD干预组(TBI+CBD组),每组24只大鼠。每个组又分为损伤后8 h、1、2、3、5和7 d共 6个时间点,观察TBI急性期损伤情况。模型组和CBD干预组大鼠的TBI模型采用改良“Feeney自由落体撞击法”制备。大鼠采用2%戊巴比妥钠(2 ml/kg)进行腹腔注射麻醉,后固定于脑立体定位仪上,头顶部消毒后,以矢状缝右侧2.5 mm和冠状缝下侧2 mm为中心,开一个直径约6 mm的骨窗。将40 g砝码通过铜管从15 cm高度落下,打击撞击子至脑组织从而造成TBI。止血后用骨蜡封闭骨窗并缝合皮肤。假手术组不进行打击,其余步骤相同。CBD粉末先溶于DMSO,再使用2% Tween-80生理盐水稀释至终浓度为1%。在TBI大鼠造模前30 min、TBI造模后6 h以及之后每 d直至取材前1 d对CBD干预组大鼠进行CBD(10 mg/kg)[8]腹腔注射。模型组注射等体积溶剂(2% Tween-80生理盐水)。根据免疫组化检测Occludin和ZO-1蛋白阳性表达的实验结果,以及课题组前期探索出脑损伤高峰期为2 d,后续模型组使用造模后2 d(TBI 2d+vehicle组)大鼠进行后续实验。

1.2.2免疫组织化学染色检测脑组织Occludin、ZO-1蛋白阳性表达 3组大鼠,在6个不同时间点处死,提取脑组织经4%多聚甲醛固定后进行石蜡包埋,制备厚度为5 μm的冠状石蜡切片。利用即用型免疫组化超敏UltraSensitiveTMSP试剂盒进行免疫组织化学染色。切片常规脱蜡至水后,进行高温高压抗原修复,冷却至室温,滴加试剂1(内源性过氧化物酶阻断剂)室温孵育10 min,试剂2(非特异性染色阻断剂)室温孵育20 min,滴加兔抗大鼠ZO-1多克隆抗体或兔抗大鼠Occludin多克隆抗体(1∶500)于4 ℃冰箱过夜,次日室温接着孵育30 min至室温,滴加试剂3(生物素标记的羊抗兔IgG聚合物)室温孵育1 h,滴加试剂4(链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶)室温孵育15 min,DAB显色,梯度乙醇脱水、二甲苯透明后使用中性树胶封固切片。采图部位位于打击损伤处靠近中缝的位置,采集大脑损伤侧皮质区染色结果图,每张切片随机选取5个视野,使用ImageJ软件分析免疫阳性细胞的平均光密度值。

1.2.3免疫荧光染色检测脑组织Occludin、ZO-1蛋白阳性表达情况 石蜡切片抗原修复后,使用10%山羊血清室温封闭1 h,滴加兔抗大鼠ZO-1多克隆抗体或兔抗大鼠Occludin多克隆抗体(1∶200)于4 ℃冰箱过夜,次日室温复温30 min后,滴加Cy3标记的山羊抗兔IgG抗体(1∶200)室温孵育1 h,使用含有DAPI的抗荧光衰减封片剂封片。采图部位位于打击损伤处靠近中缝的位置,采集大脑损伤侧皮质区染色结果图,每张切片随机选取5个视野,使用ImageJ软件分析阳性细胞的平均荧光强度。

1.2.4Western blot实验检测脑组织Occludin、ZO-1蛋白表达量 提取各组大鼠损伤侧皮质区脑组织蛋白,通过BCA法测定蛋白浓度。每孔取20 μg样品蛋白,通过SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白分离,电转移至PVDF膜,室温下用5%脱脂牛奶封闭2 h后,用1∶1 000的兔抗大鼠Occludin或ZO-1多克隆抗体和1∶5 000的兔抗大鼠β-actin多克隆抗体4 ℃摇床孵育过夜,次日用1∶10 000的HRP标记的山羊抗兔IgG二抗室温孵育1 h。采用高灵敏化学发光检测试剂盒和ChemiDocTMXRS+凝胶成像系统显色并进行采图,使用ImageJ软件分析灰度值。

1.2.5荧光素钠法检测大鼠BBB通透性 建立荧光素钠溶液浓度为0～0.05 μg/ml的荧光强度值标准曲线,R2=0.997。3组大鼠2 d后以2 ml/kg的剂量腹腔注射荧光素钠溶液(100 mg/ml,溶解于PBS中),循环30 min后麻醉大鼠进行造模,心脏灌注取损伤侧脑皮质组织100 mg,加入500 μl的7.5%TCA研磨成匀浆,再加入500 μl的PBS冲洗混匀,4 ℃、10 000 r/min离心10 min,收集上清液。黑色96孔板中每孔加入120 μl上清液和30 μl的5 mol/L NaOH,用多功能酶标仪在excitation 波长485 nm和emission 波长530 nm处测定样本荧光强度值,带入标准曲线算出荧光素钠浓度。

2 结果

2.1 CBD干预后上调TBI大脑损伤侧皮质区Occludin、ZO-1蛋白阳性表达3组大鼠免疫组化结果显示,Occludin、ZO-1蛋白阳性表达呈点状及不规则形状(图1A、B)。对Occludin、ZO-1蛋白阳性表达进行统计发现,与Sham组相比,随着时间推移,不同时间点的TBI+vehicle组Occludin、ZO-1蛋白阳性表达均下降,其中2 d下降最明显(tOccludin=3.570、4.053、7.479、5.290、4.590、3.622,均P<0.05;tZO-1=2.823、4.112、4.681、3.925、4.924、3.667,均P<0.05);与TBI+vehicle组相比,TBI+CBD组Occludin、ZO-1平均光密度值在1 d后均升高(tOccludin=4.444、7.699、3.432、4.916、4.194,均P<0.05;tZO-1=0.142、2.858、3.251、3.697、2.970、3.406,均P<0.05)。见图1C、D。

图1 免疫组织化学染色检测各组大鼠紧密连接蛋白Occludin、ZO-1阳性表达

2.2 CBD干预TBI大脑损伤侧皮质区Occludin、ZO-1平均荧光强度值升高3组大鼠免疫荧光实验结果显示,Occludin、ZO-1阳性表达成点状、条索状或不规则状(图2A、B)。对二者阳性表达的平均荧光强度值进行统计发现,与Sham组相比,TBI 2 d+vehicle组Occludin、ZO-1平均荧光强度值下降(t=2.593、3.735,均P<0.05);与TBI 2 d+vehicle组相比,CBD干预后平均荧光强度值均升高(t=3.227、3.523,均P<0.05)。见图2C、D。

图2 免疫荧光染色检测各组大鼠损伤侧皮质区Occludin、ZO-1平均荧光强度表达情况

2.3 CBD干预TBI大脑损伤侧皮质区Occludin、ZO-1蛋白表达量升高Western blot实验结果显示,与Sham组相比,TBI 2 d+vehicle组Occludin、ZO-1蛋白表达量下降(t=4.861、6.048,均P<0.01);与TBI 2 d+vehicle组相比,CBD干预后Occludin、ZO-1蛋白表达量均升高(t=6.067、4.320,均P<0.05),见图3。

图3 Western blot检测各组大鼠损伤侧皮质区Occludin、ZO-1蛋白表达量

2.4 CBD干预TBI大鼠BBB渗透性降低荧光素钠实验结果显示,与Sham组相比,TBI 2 d后,大鼠脑皮质组织的荧光素钠含量上升(t=5.156,P<0.01),提示BBB渗透性升高;与TBI 2 d+vehicle组相比,CBD干预后大鼠脑皮质组织的荧光素钠含量明显下降(t=2.785,P<0.05),提示BBB渗透性下降。见图4。

图4 大鼠脑皮质组织荧光素钠荧光强度的比较

3 讨论

TBI在全国乃至全球的致残率、致死率仍居高不下,TBI后BBB的破坏是继发性脑损伤的风险之一。BBB作为维持大脑稳态的关键结构,其完整性具有重要意义。当BBB结构遭到破坏,其渗透性发生变化,从而导致大脑内环境遭到破坏。本研究结果显示,TBI后大鼠Occludin和ZO-1均下降,这与Yan et al[9]人研究结果一致。同时本研究显示Occludin和ZO-1在TBI后2 d表达量最低,证明了紧密连接蛋白Occludin和ZO-1参与了TBI后病理改变,TBI后大鼠BBB遭到破坏。这与Fu et al[10]人研究结果近似。另外有研究[11]显示,大鼠低压缺氧后7 d脑组织荧光素钠含量明显升高,说明BBB完整性受损,通透性升高,这与本研究结果近似。本研究结果显示TBI后2 d脑组织荧光素钠含量升高,BBB渗透性升高,CBD干预后脑组织荧光素钠含量下降,BBB渗透性下降。

CBD是天然植物大麻的主要提取物之一,因其不具有精神活性且易穿过BBB,在多种中枢系统神经疾病中均发挥神经保护作用,具有潜在的应用价值[6-7]。Belardo et al[12]研究结果发现,口服CBD可减轻TBI小鼠的神经功能障碍。本实验结果显示,CBD干预后1、2、3、5和7 d,紧密连接蛋白Occludin和ZO-1阳性表达升高。CBD干预2 d后Occludin和ZO-1的平均荧光强度以及蛋白表达量都出现升高,同时BBB渗透性下降,以上均提示CBD对TBI后BBB的破坏具有一定的保护作用,降低了BBB渗透性,保护了BBB完整性。

综上所述,本研究显示TBI后紧密连接蛋白Occludin和ZO-1表达下降,BBB渗透性升高,CBD干预可逆转TBI对BBB的破坏。本研究为治疗TBI提供潜在有效药物,然而关于CBD干预BBB渗透性的机制还需进一步研究。