乙醇脱氢酶1A和血管内皮生长因子-A在肝细胞癌中的表达

薛乐乐,井玉莹,杨凯歌,祁力文,吴 桐,任祎琳,臧翌辰,王良海,张海俊,梁伟华,胡建明

肝癌是常见的恶性消化系统肿瘤之一,其病死率位居全球高发肿瘤的第三位,预后较差[1]。尽管最近在肝癌诊断和治疗方面有所突破,但多数肝癌患者在确诊时均为中晚期癌,接收手术切除的患者只占20%～30%,术后5年转移/复发率达60%～70%。虽然目前越来越多学者对肝癌发病和演进机制进行深入研究,但肿瘤复发、转移机制仍未完全明确。目前,病毒性肝炎和饮酒是肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)发生的主要原因。乙醇脱氢酶1A(alcohol dehydrogenase 1A,ADH1A)作为一种酒精代谢相关的关键酶,与食管癌的易感性有关,能够抑制食管癌的进展[2]。血管内皮生长因子-A(ascular endothelial growth factor-A,VEGFA)在新生血管的形成和肿瘤淋巴结转移中发挥重要作用。但是,在HCC中ADH1A和VEGFA的相关研究较少。为进一步明确ADH1A和VEGFA在HCC进展和预后中的作用,该研究通过分析ADH1A和VEGFA在HCC中的表达情况和相关性,结合病例样本中ADH1A和VEGFA的表达及与临床病理参数和预后的相关性分析,探讨ADH1A和VEGFA在预测HCC患者临床进展和不良预后的作用和意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1病例资料 本研究回顾性收集2012年1月—2018年1月在石河子大学第一附属医院行手术并确诊的HCC病例的临床病理资料,选取了病例资料较为齐全的HCC组织样本84例,所有的HCC样本均经病理医师确诊,并按2019年WHO标准分级,入选标准如下:① 单发肝癌;② 根治性手术切除;③ 术后病理证实为HCC;另选取符合条件的HCC癌旁正常组织43例,并对所有患者通过电话及信件方式进行随访,随访时间约为1～95个月,25例失访,总共获得59例患者的随访资料,其中43例存活,16例死亡。该研究得到石河子大学第一附属医院伦理委员会的批准(批号:KJ2022-069-01)。

1.1.2抗体、试剂和仪器 兔抗人ADH1A(货号:ab108203)购自英国Abcam公司;小鼠抗人VEGFA购自美国Santa Cruz公司(货号:sc-7269);辣根酶标山羊抗兔IgG聚合物(货号:ZB-2301)、辣根酶标山羊抗鼠IgG聚合物(货号:ZB-2305)以及DAB显色液(货号:ZLI-9018)购自北京中杉金桥生物技术有限公司;EDTA抗原修复液(货号:C1003)购自北京索莱宝科技有限公司。显微镜(型号:BX51TF)购自日本奥林巴斯Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1免疫组化染色 将HCC石蜡切片置于60 ℃的温箱中烤30 min,然后进行二甲苯和乙醇脱蜡水化,用枸橼酸或EDTA进行高温修复,冷却后置于H2O2中10 min,PBS洗3次后4 ℃孵育一抗ADH1A(1∶1000)和VEGFA(1∶1 000)14 h,次日分别滴加二抗辣根酶标山羊抗兔IgG聚合物(1∶100)和辣根酶标山羊抗鼠IgG聚合物(1∶100),37 ℃孵育2 h,DAB显色,显色后水洗,苏木精染色,酸酒精分化4～5 s,然后自来水返蓝5 min,最后乙醇脱水,封片后于显微镜下观察。

1.2.2免疫组化结果评定 ADH1A和VEGFA均为胞质染色,具体免疫组化评定参照之前的研究[3]。染色阳性细胞比例评分:Score1(0分:≤5%;1分:6%～25%;2分:26%～50%;3分:51%～75%;4分:76%～100%);阳性细胞染色强度:Score2(0:缺失;1:弱阳性;2:中等阳性;3:强阳性)。最终评分依据为两者乘积,即Score1×Score2,<3分为低表达,≥3分为高表达。

1.2.3ADH1A基因富集分析以及临床相关性分析 从肿瘤基因组图谱(the cancer genome atlas program,TCGA)[4]数据库(https://cancergenome.nih.gov/)中下载了374例HCC患者和50例HCC患者癌旁的mRNA和相应的临床数据,并且使用“limma”R pack对基因表达谱进行标准化,随后,以KEGG和GO的基因集为参照,利用基因富集分析(gene set enrichment analysis,GSEA)[5]识别HCC和癌旁正常组织之间差异显著的通路并对比HCC患者组织和癌旁组织ADH1A差异表达的时候HCC信号通路的表达差异情况,循环次数设置为1 000次,满足P<0.05以及FDR-q<0.25时被认为有统计学意义。基于基因表达谱交互分析(gene expression profiling interactive analysis,GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析了ADH1A和VEGFA的相关性。

1.3 统计学处理应用SPSS 27.0软件进行统计分析,采用Fisher精确概率法分析ADH1和VEGFA在HCC和癌旁组织中的表达差异情况,四格表χ2检验分析ADH1A、VEGFA与临床病理参数的关系;采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,采用Log-rank检验分析ADH1A和VEGFA蛋白表达水平与HCC的总生存率的关系。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADH1A差异表达对基因相关通路的影响GSEA分析发现,在HCC和癌旁正常组织中的ADH1A差异表达时,基因相关通路如PPAR、NOTCH、WNT和VEGF的表达差异均有统计学意义(均FDR-q<0.250,P<0.05)。其中,VEGF(图1A)、WNT(图1B)、NOTCH(图1C)通路和ADH1A呈负相关,PPAR(图1D)和ADH1A呈正相关。

图1 GSEA分析ADH1A在HCC中的相关通路

2.2 ADH1A和VEGFA在HCC和癌旁组织中的表达及相关性GEPIA分析发现,ADHA在HCC组织中(369例)低表达,在癌旁正常组织(50例)高表达(P<0.05)(图2A),而VEGFA则相反(P<0.05)(图2B)。并且在HCC中,ADH1A和VEGFA的表达呈负相关(r=-0.14,P<0.01)(图2C)。

图2 在线网址分析ADH1A和VEGFA在HCC和癌旁的表达和两者的相关性

2.3 HCC组织中ADH1A和VEGFA的蛋白表达与患者临床病理参数的相关性免疫组化染色可见ADH1A和VEGFA均在胞质中表达。癌旁正常组织中ADH1A蛋白阳性表达率为100%(43/43),84例HCC组织标本中有40例ADH1A蛋白呈阳性表达,阳性表达率为47.61%(40/84),明显低于癌旁正常组织(χ2=33.169,P<0.001)。HCC中VEGFA阳性表达率为59.52%(50/84),高于癌旁正常组织[4.70%(2/42)](χ2=21.346,P<0.001)。见图3。此外,HCC组织中ADH1A蛋白表达和VEGFA蛋白表达呈负相关(r=-0.22,P<0.05)。见图4。进一步结合病例样本的临床病理参数分析发现,HCC组织中ADH1A高表达组的肿瘤脉管癌栓和复发的比例更低(均P<0.05),而VEGFA高表达组中肿瘤直径>5 cm、高TNM分期、有微卫星以及G2-G3分化程度比例更高(P<0.05),见表1、2。提示HCC患者ADH1A低表达和VEGFA的高表达可能预示肿瘤的快速进展。

表1 ADH1A与HCC临床病理参数的关系[n(%)]

表2 VEGFA表达与HCC临床病理参数的关系[n(%)]

图3 HCC和癌旁组织中ADH1A和VEGFA的表达 ×400

图4 HCC组织中ADH1A与VEGFA表达的相关性分析

2.4 ADH1A的高表达与VEGFA的低表达与HCC患者预后较好有关为了进一步研究ADH1A和VEGFA的表达差异是否对HCC患者的临床预后产生影响。本研究通过Kaplan-Meier生存分析发现,ADH1A高表达HCC患者的五年生存率高于ADH1A低表达的患者(Log rankP=0.003)(图5A),而VEGFA的表达状态与HCC患者的五年生存率差异无统计学意义(Log rankP=0.634)(图5B),进一步分析了ADH1A高表达同时VEGFA低表达、ADH1A低表达同时VEGFA高表达、ADH1A高表达同时VEGFA高表达以及ADH1A低表达同时VEGFA低表达的HCC患者预后情况,结果显示ADH1A高表达同时VEGFA低表达的五年生存率优于其他形式表达的肿瘤患者(Log rankP=0.004)(图5C),以上图片均为检剔后线段。

图5 不同ADH1A和VEGFA蛋白表达HCC患者的生存曲线

3 讨论

原发性HCC有三种主要组织学类型,即HCC、肝内胆管细胞癌和混合型癌[1]。HCC占全世界原发性HCC病例的80%以上[6],在中国发病率和病死率更加严峻[7]。因此,深入了解HCC的危险因素并且积极探索其可能的分子机制,寻找用于HCC复发转移的标志及有效的分子靶点对于改善HCC患者的预后与生存具有十分重要的意义。

ADH1A属于第一类乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH),ADH由ADH1A、ADH1B、ADH1C组成[8],ADH1A对HCC发生发展的作用鲜有研究。本研究疫组化实验检测结果显示,癌组织中ADH1A的蛋白表达水平较癌旁组织低,并且与患者

的复发和有无癌栓等预后相关。本研究结果与目前关于ADH1A蛋白在如HCC、结肠癌、胃癌、食管鳞癌、肺癌等恶性肿瘤中的研究结果类似[9-12]。

本研究分析了84例HCC患者的临床病理特征,发现伴随HCC组织中ADH1A表达的降低,患者发生脉管癌栓以及复发的比例增高。本研究Kaplan-Meier生存分析结果显示,HCC患者ADH1A蛋白高表达较低表达患者的五年生存率高,说明ADH1A蛋白的高表达与患者良好的预后有关。Liu et al[12]发现ADH1A在HCC组织中的表达明显低于正常肝组织,此外,ADH1A的高表达与HCC患者的良好预后相关。Mao et al[13]也发现,ADH1A抑制非小细胞肺癌细胞存活和迁移,表明ADH1A可能具有肿瘤抑制作用。上述研究与我们的研究结果相似,提示ADH1A高表达可能是HCC患者良好预后的重要评价指标之一。

VEGFA是推动肿瘤血管床扩张的主要因素之一[14]。VEGFA诱导血管通透性增加、跨细胞气孔的形成和细胞旁连接的瞬时开放。在本研究中,VEGFA高表达,HCC肿瘤的直径大、分化程度差,微卫星灶出现的比例也大,同时肿瘤患者的临床分期也提升,提示VEGFA的高表达可能与HCC的快速进展有关。本研究Kaplan-Meier生存分析发现,VEGFA蛋白高表达患者五年生存率低于VEGFA蛋白低的表达患者,但没有统计学意义,这可能和我们的样本量相对较小有关。本研究还分析了ADH1A和VEFGA单独表达以及两者同时表达的作用。结果表明,ADH1A高表达同时VEGFA低表达较其他组合形式蛋白表达患者的生存率均高,提示ADH1A高表达同时VEGFA低表达可以作为HCC患者较好预后评估的重要参考指标之一。