淋巴细胞亚群联合趋化因子对儿童原发免疫性血小板减少症诊断价值研究

沈晨涛,夏亚林,盛烨萍,褚培培,李建琴

原发免疫性血小板减少症(immunologic thrombocytopenic purpura,ITP)也称特发性血小板减少性紫癜,该病是一组以血小板生成减少、清除率增加为表现的出血性疾病,在儿童中高发,尤其以4～6岁儿童较为常见,该病发病率约8.4人/10万[1-2]。目前ITP的诊断仍基于临床排除法和骨髓穿刺等实验室检查,在排除其他原因所致血小板减少后,才能确诊为ITP,骨髓穿刺可对机体造成创伤,不适用于早期筛查[3],因此有必要采取其他方法以筛查ITP。虽然ITP的发病机制尚未完全明确,但现有的研究[4]证明血小板生成抑制及血小板破坏是引起血小板减少的直接原因,辅助性T淋巴细胞1/辅助性T淋巴细胞2(helper T cells 1/helper T cells 2,Th1/Th2)相关趋化因子的异常表达在ITP患者免疫异常中发挥了重要作用,可能是ITP的发病因素之一;另有研究[5]发现ITP患儿自身抗原的异常表达所引起自身反应性T淋巴细胞亚群被激活,促进体内血小板抗体分泌也可能是ITP发生的原因之一。该研究选择淋巴细胞亚群及趋化因子进行分析,探讨上述指标联合检测对儿童ITP诊断价值,以期为儿童ITP的早期筛查诊断提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1病例资料 将2021年1月—2023年2月苏州市吴江区儿童医院与苏州大学附属儿童医院接诊的132例拟诊为ITP的患儿纳入本次研究。纳入标准:① 有不同程度的出血表现;② 经连续2次以上检血小板计数(blood platelet,PLT)<100×109/L;③ 无血小板减少症相关治疗史;④ 年龄在14岁及以下;⑤ 研究对象家属已签署知情同意书。排除标准:① 采血前1个月内有免疫抑制剂治疗史的患者;② 近1个月内有疫苗接种史或输血史的患者;③ 人类免疫缺陷病毒感染者;④ 继发性血小板减少症患者。

1.1.2主要试剂和仪器 CD4、CD8及CD3单克隆抗体[法国 IMMUNOTECH S.A.S(美国贝克曼库尔特有限公司法国分公司)],货号:A07752、A07758、A07749);流式细胞分析用溶血素(美国碧迪生物科学公司,货号:349202);PBS缓冲液(北京百奥莱博生物科技有限公司,货号QP0342);人CC类趋化因子配体5(chemokine (C-C motif) ligand 5,CCL5)、人单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1,MCP-1) ELISA试剂盒(上海臻科生物科技有限公司,货号:ZK-1781、ZK-0748)、人CC类趋化因子配体11[recombinant chemokine (C-X-C motif) Ligand 1,CXCL11]ELISA试剂盒(上海禹绍生物科技有限公司,货号:YS-F11805)。多功能酶标仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司,型号:Multiskan FC);流式细胞仪(美国BD公司,型号:FACSCalibur)。

1.2 方法

1.2.1淋巴细胞亚群及趋化因子的检测 取患儿空腹外周血6 ml,分2管。其中1管1 ml置含EDTA抗凝剂试管中,避光孵育荧光标记的CD4、CD8及CD3单克隆抗体20 min后加入溶血素继续孵育8 min,PBS洗涤、离心2次(3 000 r/min,15 min)后重悬,以流式细胞仪对CD4+、CD8+及CD3+水平进行检测。另1管5 ml,置无菌Eppendorf试管中,以3 000 r/min冷冻离心15 min后分取血清,以酶联免疫吸附法对CCL5、CXCL11、MCP-1水平进行检测,操作均专业人员按试剂盒说明书进行。

1.2.2ITP的诊断 参照《诸福棠实用儿科学(第8版)》[6]儿童ITP的诊断标准:>2次血常规检测显示PLT<100×109/L,无脾脏增大表现或仅轻度增大,骨髓穿刺检查显示巨核细胞增多或正常,排除自身免疫性疾病、甲状腺疾病等其他继发性血小板减少症。根据上述标准诊断结果将患儿分为ITP组与非ITP组。

2 结果

2.1 ITP组与非ITP组一般资料比较本次纳入的患儿中男72例,女60例;年龄4～14岁,平均(6.13±1.74)岁;BMI指数18.92～24.17 kg/m2,平均(21.33±3.04)kg/m2。132例患儿中确诊为ITP共88例,44例非ITP组患者中再生障碍性贫血30例,急性白血病14例。ITP组与非ITP组患者性别、年龄、BMI指数及PLT水平差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 ITP组与非ITP组一般资料的比较

2.2 ITP组与非ITP组淋巴细胞亚群及趋化因子水平比较ITP组患者CD4+、CD3+淋巴亚群比率均低于非ITP组,CD8+淋巴亚群比率、CCL5、CXCL11、MCP-1水平均高于非ITP组(均P<0.01)。见表2。

表2 ITP组与非ITP组淋巴细胞亚群及趋化因子水平比较

2.3 ITP组患者淋巴细胞亚群和趋化因子与PLT相关性分析结果相关性分析结果显示ITP组患者CD4+、CD3+与PLT呈正相关,CD8+、CCL5、CXCL11和MCP-1与PLT呈负相关关系(均P<0.05)。见表3。

表3 ITP组患者淋巴细胞亚群联合趋化因子与PLT相关性分析

2.4 ROC分析结果ROC分析结果显示,CD4+、CD8+、CD3+、CCL5、CXCL11和MCP-1对儿童ITP诊断的截断值分别为27.13%、24.02%、59.88%、41.02 ng/L、30.18 ng/L和188.27 ng/L,AUC分别为0.893、0.880、0.629、0.801、0.892和0.751,六者并联诊断(指并联检测时CD4+、CD3+中的一项及以上低于截断值和/或CD8+、CCL5、CXCL11和MCP-1中的一项及以上高于截断值)的AUC为0.967,其诊断效能高于各指标单独检测(Z=2.011、2.164、4.521、2.286、2.012、2.788,P=0.044、0.030、0.000、0.022、0.044、0.005)。见图1、表4。

图1 淋巴细胞亚群联合趋化因子诊断ITP的ROC曲线

表4 淋巴细胞亚群联合趋化因子诊断ITP的ROC分析

3 讨论

ITP为自发性出血性疾病的一种,儿童出血性疾病中ITP占比较高[7],临床实践中发现ITP较多具有自限性,病程多为4～6周,但较大龄的儿童及青少年中患有慢性ITP的可能性更高[8]。ITP发病机制目前尚不明确,但研究[9]表明免疫应答紊乱与该病的发生密切相关,细胞免疫及体液免疫异常均有可能诱发ITP,尤以细胞免疫异常较为常见。T淋巴细胞亚群检测在临床中常用于自身免疫疾病、血液疾病、变态反应性疾病的辅助诊断;趋化因子在细胞迁移、细胞凋亡调控、白细胞聚集及细胞因子产生等方面发挥重要作用,同时还在多种疾病的发生中起关键作用[10]。

正常情况下,CD4、CD8等T淋巴细胞间相互制约并诱导形成T细胞网络,对于维持机体免疫内环境稳定具有重要的意义。本研究结果显示,ITP组患者CD4+、CD3+淋巴亚群比率均低于非ITP组,CD8+淋巴亚群比率高于非ITP组,与先前的研究相一致[11]。CD4+为免疫反应中起主要反应的T细胞,并有增强、扩大其他免疫细胞作用的功能,因而CD4+水平下降意味着患儿的免疫功能下降;CD8+则具有抑制T细胞活化及B细胞抗体产生的作用,其水平升高反而预示着患儿的免疫功能降低[12]。本研究进一步经相关性分析结果显示,ITP组患者PLT与CD4+、CD3+呈正相关关系,与CD8+呈负相关关系;考虑可能与ITP患儿CD4+、CD3+淋巴亚群比率下降,CD8+淋巴亚群比率升高使机体中参与免疫反应的细胞随之下降,导致机体免疫平衡被破坏进而影响机体免疫功能,进一步导致自身反应性T细胞被激活,引起B细胞活化、增殖并产生相应抗体,引起细胞、体液免疫异常破坏血小板有关[13]。

在ITP发病过程中免疫细胞的异常分化需经血小板的趋化运动才可发挥相应的生物学效应。本研究发现,ITP组患者CCL5、CXCL11和MCP-1水平均高于非ITP组,CCL5为趋化因子受体CCR5的高亲和力配体,CXCL11则为CXCR3受体高亲和力配体。研究[14]发现上述两种受体均在Th1细胞表面高表达,CCL5、CXCL11可通过与相应受体结合而引起Th1细胞紊乱,引起自身反应性B细胞分泌抗血小板抗体进而破坏血小板。MCP-1为单核巨噬细胞的趋化因子,其可通过提高单核巨噬细胞活性而破坏血小板[15]。本研究相关性分析结果显示,CCL5、CXCL11和MCP-1与血小板计数呈负相关,可能与随着CCL5、CXCL11和MCP-1水平的升高,其介导的Th1细胞、单核巨噬细胞趋化运动更强,增强了Th1细胞及单核巨噬细胞对血小板破坏作用有关。

本研究进一步ROC分析结果显示,六者并联诊断的诊断效能高于各指标单独检测,可能与不同指标仅能反映各自的部分功能有关,而并联检测可将不同指标所反映的机体状况整合,使诊断效能更高。需要注意的是,本研究结果仍需结合血常规、临床诊断指标才能起到最佳的筛查效果,儿童ITP确诊仍需行骨髓穿刺,本研究结果可用于提高早期筛查敏感度,在出血症患儿中精准识别出ITP高风险人群,减少不必要的骨髓穿刺检查。

综上所述,CD4+、CD8+、CD3+、CCL5、CXCL11和MCP-1均可用于儿童ITP的诊断,各指标并联检测可提高检测效能。因本研究仅对比了ITP与再生障碍性贫血、急性白血病等非ITP患儿的上述指标,未设置健康儿童作为对照,后续的研究中将增加指标、增加中心、扩大样本量,并增设健康对照组以进一步证实本研究结果。