哺乳动物不育系20样激酶1基因多态性与结直肠癌的关联分析

马立聪,阎小霞,高 芳,董文杰,李迎泽,贾彦彬

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)也称大肠癌,是常见的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率均位于常见恶性肿瘤的第五位[1]。结直肠癌患者发现时往往已达中晚期,手术切除是治疗结直肠癌常见的手段之一,但术后常出现肝转移和肺转移,5年生存率不足10%[2-3]。因此,早发现、早诊断、早治疗是防治结直肠癌的关键,寻找经济有效的结直肠癌早期诊断的生物标志物对于寻找结直肠癌高危人群至关重要。

哺乳动物不育系20样激酶1(mammalian sterile 20-like kinase 1,MST1)是Hippo肿瘤抑制通路中的上游分子,前期研究[4]报道,在胃肠道肿瘤中,MST1往往表达降低。研究[5]证明,结直肠癌的发病过程与单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)相关。目前,缺乏对于MST1SNPs与结直肠癌相关性的研究,本研究通过病例-对照关联研究的方法,在包头地区汉族人群中检测MST1基因多态性及其单体型,同时研究其与结直肠癌发病风险的关联性,并对疾病进行分层分析,明确MST1SNPs与结直肠癌发生、发展的关系,旨在为结直肠癌早期诊断和治疗找到新的突破口。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2018年9月—2019年10月在包头市肿瘤医院经病理学确诊为结直肠癌的患者390例(直肠癌:216例,结肠癌:174例)为病例组,纳入标准为:新发病例,尚未接受过放化疗,无其他既往癌症病史。收集同期于包头医学院第一附属医院进行正常体检的人群413例为对照组,纳入标准为:无消化系统疾病和遗传病史。所有患者和体检人群要求为汉族,无与其他民族通婚史,在包头市生活5年以上,采用EDTA抗凝管留取2 ml外周血。所有参与者均提供知情同意书,该项目获包头医学院医学伦理委员会审查通过:包医伦理人体2021第(007)号。

1.2 SNP的筛选和基因分型SNP的筛选方法已在其他文章中详细描述[6],简要来说:根据美国国家生物技术信息中心-人类单体型图数据库(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)提供的中国汉族人群遗传多态性数据进行筛选,筛选范围包括基因第一个外显子上游20 kb和最后一个外显子下游10 kb的序列,以保证包含了基因的调控序列,要求筛选的SNP在中国汉族人群中的最小等位基因频率(minor allele requency,MAF)>5%,连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD) 相关系数r2>0.8。采用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司,货号:YDP348-03)提取所有血液样本的基因组DNA。采用Taqman探针法对筛选出的SNPs进行分型,并随机选取5%DNA样本进行重复实验,基因分型由北京赛默百合生物科技有限公司完成。

1.3 统计学处理采用SPSS 26.0软件对数据进行分析。采用卡方检验检测各SNP的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡,以检验本研究所选的样本在群体中是否具有代表性;秩和检验比较年龄因素在病例组和对照组之间的分布差异;卡方检验比较性别因素以及单体型频率在病例组和对照组之间的分布差异;Logistic回归计算经年龄、性别调整后的比值比(odds ratio,OR)以及95%置信区间(confidence interval,CI),用以评估四个SNP在共显性、显性、超显性、隐性四种遗传模型下与结直肠癌的关联,以及评估单体型与结直肠癌的关联,并对疾病进行分层分析。计算赤池信息准则(akaike information criterion,AIC)和贝叶斯信息准则(Bayesian information criterion,BIC)来评价模型拟合优良性,AIC 和 BIC 的值越小,则表示模型对数据的拟合度越好此,模型则为最佳模型。采用SHEsis软件对筛选出的MST1基因的SNP按照其在基因上的位置顺序构建单体型,并计算经标准化的连锁不平衡系数D′值和r2值用于评估连锁不平衡状态。当D′=0,r2=0时,处于完全连锁平衡状态;当D′=1,r2=1时,处于完全连锁不平衡状态。D′值和r2值越接近1,连锁不平衡程度越高。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象一般情况的比较病例组中,男性234人(60.0%),女性156人(40.0%),平均年龄(60.82±10.94)岁。对照组中,男性261例(63.2%),女性152例(36.8%),平均年龄(57.24±10.78)岁。经统计分析,各病例组平均年龄较正常人组更高,年龄因素在正常人组和结直肠癌组(Z=-5.007,P<0.001)、正常人组和结肠癌亚组(Z=-3.585,P<0.001)以及正常人组和直肠癌亚组(Z=-4.491,P<0.001)间的分布差异均有统计学意义;与正常人比较,结肠癌组女性患者比例更高,分布差异有统计学意义(χ2=4.860,P=0.027),正常人组与结直肠癌组和直肠癌亚组之间的性别分布差异无统计学意义(χ2=0.867、0.266,均P>0.05)。见表1。

表1 研究对象一般情况的比较

2.2 SNP筛选和基因分型结果本研究共筛选出MST1基因4个SNPs,即rs8000,rs2234197,rs2267853,rs6073629。基因分型结果见表2。分型成功率均大于95%,5%样本的重复实验一致率为100%。

表2 基因分型结果[n(%)]

图1 MST1 4个SNPs的单体型构建图(以结直肠癌为结局变量)

表3 四种遗传模型下各SNP与结直肠癌发病风险的Logistic 回归分析结果

表4 MST1单体型与结直肠癌的关联分析

2.4 各SNP及单体型与直肠癌发病风险的关联性分析结果Logistic 回归分析结果显示,MST1SNP rs2234197 AG基因型在共显性和超显性遗传模型下均与直肠癌发病风险相关联(均P<0.05)。因超显性遗传模型AIC和BIC值最小,提示超显性遗传模型为最适遗传模型,与携带GG+AA基因型者相比,携带AG基因型者直肠癌发病风险降低[OR(95%CI)=0.657(0.442～0.976)]。见表5。以直肠癌为结局变量构建单体型,并分析单体型与直肠癌发病风险的关系。结果显示,共构建出5个单体型,即AGAG,AGGT,GAGG,GGAG和GGGT,各单体型与直肠癌发病风险均无关联(均P>0.05)。见表6。rs6073629与rs8000(D′=0.991,r2=0.460)和rs2267853与rs8000(D′=0.936,r2=0.288)之间分别存在强连锁不平衡,构成单体型块。见图2。

图2 MST1 4个SNPs的单体型构建图(以直肠癌为结局变量)

表5 四种遗传模型下各SNP与直肠癌发病风险关联性的Logistic 回归分析结果

表6 MST1单体型与直肠癌的关联分析

2.5 各SNP及单体型与结肠癌发病风险的关联性分析结果Logistic 回归分析结果显示,MST1SNP rs8000在隐性遗传模型下与结肠癌发病风险相关,与携带TT+GT基因型者相比,携带GG基因型者结肠癌发病风险降低[OR(95%CI)=0.425(0.182～0.992)]。见表7。以结肠癌为结局变量构建单体型,并分析单体型与结肠癌发病风险的关系。结果显示,共构建出5个单体型,即AGAG,AGGT,GAGG,GGAG和GGGT,各单体型与结肠癌发病风险均无关联(均P>0.05)。见表8。rs6073629与rs8000(D′=1.000,r2=0.471)和rs2267853与rs8000(D′=0.931,r2=0.281)之间分别存在强连锁不平衡,构成单体型块。见图3。

图3 MST1 4个SNPs的单体型构建图(以结肠癌为结局变量)

表7 四种遗传模型下各SNP与结肠癌发病风险关联性Logistic 回归分析结果

表8 MST1 单体型与结肠癌的关联分析

3 讨论

结直肠癌的发生发展过程复杂,是性别、年龄、饮食、吸烟、环境和遗传等多因素作用的结果[7],目前,MST1与肿瘤的关系已被少量报道[8-10]。在胃肠道肿瘤中,MST1表达减少,下调了对下游大肿瘤抑制激酶1/2以及效应因子Yes相关蛋白/PDZ结合域转录共刺激因子的磷酸化作用,导致组织过度生长和肿瘤的发生[11]。肠道增生性腺瘤是结直肠癌癌前病变的最常见形式,Qin et al[12]通过特异性条件敲除小鼠的MST1基因发现,实验小鼠肠绒毛结构紊乱,未分化细胞膨胀,可见异常增生的上皮细胞和腺瘤形成。Wu et al[13]研究发现,重组的MST1能够抑制人结直肠癌细胞系SW480的增殖,并诱导其凋亡。遗传因素是影响结直肠癌发生发展的主要因素,并且有明确的文献[7]报道,基因的单核苷酸多态性与结直肠癌的发病相关。Gong et al[5]发现KBTBD11基因SNP rs11777210与其附近的MYCSNP rs6983267之间存在交互作用,并且与携带 rs6983267 TT-rs11777210 TT基因型人群相比,携带rs6983267 GG-rs11777210 CC 基因型者结直肠癌易感性提高2.83倍。

本研究对MST1基因SNP与结直肠癌发病风险的关联性进行了研究,并对疾病进行分层分析。在对疾病分层前,并未发现MST1各SNP与结直肠癌发病风险相关。随后,本研究将结直肠癌分层为直肠癌和结肠癌,分析结果显示,当以直肠癌为结局变量时,SNP rs2234197与直肠癌发病风险相关,与携带GG+AA基因型者相比,携带AG基因型者直肠癌发病风险降低,提示rs2234197 AG基因型或许是直肠癌的保护性因素。目前有关该SNP与疾病的关联研究尚无报道,本研究的实验结果为其他学者对该SNP的进一步研究提供依据。当以结肠癌为结局变量时,本研究发现SNP rs8000与结肠癌发病风险相关,与携带TT+GT 基因型者相比,携带GG基因型者结肠癌发病风险降低,提示rs8000 GG基因型可能是结肠癌的保护性因素。关于rs8000的研究报道非常有限,目前仅有Shen et al[14]研究了rs8000与肝细胞癌的关联性,但并未发现两者之间存在关联,这提示MST1SNP rs8000在不同消化系统肿瘤中所起的作用可能不同。分层分析结果说明同一SNP在不同部位的肠癌中的作用可能不同。

总之,本研究通过筛选MST1基因潜在致病的SNP位点,并分析了SNPs与结直肠癌、直肠癌及结肠癌发病风险的关联性,发现了MST1基因SNP rs2234197 AG基因型和SNP rs8000 GG基因型可能分别是直肠癌和结肠癌的保护性因素,该发现可能为结直肠癌患者的诊治提供依据。本研究尚存在一些不足之处。第一,本研究基于基因水平,所研究的SNP是否影响其编码的蛋白MST1的表达水平和功能,并影响Hippo信号通路中位于其下游的分子的表达和功能,进一步导致了疾病的发生发展尚不清楚,未来需要进一步通过体内和体外实验验证本文中所研究的SNP位点的功能。第二,研究样本纳入量较小,且纳入人群仅为汉族,因此还需扩大样本量在不同的人群中进一步证实本研究的发现。第三,虽然已严格限制样本的纳入条件,但病例组和对照组的样本来源于不同的医院,这可能会对研究结果产生偏倚。