河北唐山汉族人群VDR和MBP基因交互作用与肺结核发病的相关性*

冯福民,郝金奇,陈 怡,孙淑丰,郑国颖,陈 刚

(华北煤炭医学院:1.流行病与卫生统计学科,河北省煤矿卫生与安全重点实验室;2.护理学系中心实验室,河北唐山063000)

遗传学研究表明肺结核发病是多基因与环境因素共同作用的结果。国内外学者分别对 NRAM P1[1]、VDR[2]、MBP[3]、HLA[4]等基因的多态性与人群肺结核病发病的相关性进行了研究,但是,现有研究主要考察了单个基因与肺结核病易感性的关系,存在较大的局限性,基因与基因之间可能存在的交互作用尚未得到有效论证。尤其是对于复杂性状的慢性病,基因和环境因素的交互作用在其中扮演着十分重要的“角色”认识不清。本研究在分别探讨VDR基因和MBP基因与人群肺结核发病的基础上,着重分析两个基因在肺结核发生中是否存在交互作用及其作用方向和大小。

1 对象与方法

1.1 研究对象 病例组182例来自2006年8月至2007年12月经唐山市结核病医院确诊的汉族成年新发肺结核患者。全部病例按照1998年修订的《中国结核病分类法》标准诊断,年龄大于或等于18岁;除外慢性阻塞性肺疾病、哮喘、肺癌、尘肺、肺炎、糖尿病、长期使用肾上腺皮质激素及其他免疫抑制剂、HIV感染等免疫功能低下者。对照组190例来自唐山市健康体检中心,与病例同期的汉族成年健康体检者。经PPD试验确认有结核分支杆菌感染,年龄大于或等于18岁,与纳入的病例或对照无血缘关系,排除标准与病例相同。

1.2 研究内容和方法

1.2.1 流行病学调查 按照文献资料提供的信息及本研究的设计要求统一设计调查表,征得研究对象知情同意,现场询问其一般情况,烟酒、卫生、饮食等生活习惯,家庭经济、住房状况,本人疾病史、结核患者接触史、卡介苗接种史,家族结核病史等。

1.2.2 基因多态性分析 采集研究对象空腹静脉血3 mL,EDTA抗凝。采用盐析法提取人基因组DNA。根据参考文献和基因库中人类VDR和MBP基因序列特征,借助 primer premier5.0软件设计PCR引物,送北京赛百盛基因技术有限公司合成,其基因位点和引物序列为:VDR TaqⅠ位点,454 bp,5′-caa cca aga cta ca agt acc gcg tca gtg 和 5′-ctg gaa gga gag gca gcg gta ctg;VDR Apa Ⅰ 位点,1 935 bp,5′-caa cca aga cta caa gta ccg cgt cag tg 和 5′-gag cac aag ggg cgt tag ctt cat g;VDR Fok Ⅰ 位点,267 bp,5′-agc tgg ccc tgg cac tga ctc tgg ctc和 5′-atg gaa aca cct tgc ttc ttc tcc ctc;MBP 52 位点,351 bp,5′-ggc ttc cca ggc aaa gat ggc(特异位点 C 引物)、5′-ggc ttc cca ggc aaa gat ggt(特异位点 T引物)和5′-tct tga acc tgg tgc cat ccc tac tg;MBP 54 位点,273 bp,5′-cag att gta gga cag agg gca tgc tc和 5′-tcc ccc ttt tct c(t)c ctt ggt gc(特异位点G 引物)、5′-tcc ccc ttt tct c(t)c ctt ggt gt(特异位点 A 引物);MBP 57 位点,285 bp,5′-cag att gta gga cag agg gca tgc tc 和 5′-cac gta cct ggt tcc ccc ttt tct c(特异位点 G 引物)、5′-cac gta cct ggt tcc ccc ttt tct t(特异位点A引物)。

表1 基因-基因交互作用的 Logistic回归分析结果

VDR基因3个位点多态性采用PCR-RFLP方法分析,分别是TaqⅠ(TT型:454 bp;T t型:454 bp,293 bp,161 bp;tt型:293 bp,161 bp)、ApaⅠ(AA型:1 935 bp;Aa型:1 935 bp,1 647 bp,288 bp;aa型:1 647 bp,288 bp)和FokⅠ(FF型:267 bp;Ff型:267 bp,197 bp,69 bp;ff型:197 bp,69 bp)。M BP基因3个位点多态性分析采用特异引物法,利用各个位点特异性引物进行PCR扩增,单一特异引物扩增阳性者为纯合子,两个特异引物扩增均阳性者为杂合子,同时以P54上游引物和P52下游引物组合扩增的574 bp片段作为质控来证实PCR反应的有效性。

1.3 统计学方法 以Excel 2003建立数据库,单因素、多因素、交互作用分析采用SPSS11.5软件完成。使用双侧检验,检验水准α=0.05。基因型分布的Hardy-Weinberg遗传平衡分析采用拟合优度χ2检验。

2 结 果

2.1 研究对象的基本特征及均衡性分析 病例组(男122例,女60例)和对照组(男132例,女58例)性别差异无统计学意义(χ2=0.256,P=0.613)。病例组(42.74±14.79)岁和对照组(45.86±16.26)岁年龄差异无统计学意义(t=1.931,P=0.054)。两组研究对象的农村和城市居住地差异无统计学意义(χ2=2.137,P=0.154)。表明两组人群性别、年龄、城乡居住地均衡,具有可比性。对照组VDR和MBP基因型别的Hardy-Weinberg遗传平衡检验结果表明拟合优度优良(观察值与期望值差别较小,χ2值介于 0.4～2.4之间,P＞0.05),说明对照人群处于平衡状态,具有良好的代表性,可以从基因频率来估计基因型频率。

2.2 病例组和对照组一般情况的单因素分析 单因素分析结果显示,肺结核患者接触史(OR=7.423,95%CI:3.565～15.657)、肺结核家族史(OR=3.938,95%CI:1.956～7.926)、重体力劳动(OR=1.800,95%CI:1.010～3.208)为肺结核发生的危险因素,有卡介苗接种史(OR=0.632,95%CI:0.473～0.821)、有卡痕(OR=0.535,95%CI:0.384～0.856)为肺结核发生的保护因素。

2.3 VDR、MBP基因多态性与肺结核发生的关系 病例组中,TaqⅠ、ApaⅠ、FokⅠ、P52、P54位点的突变型纯合子分别占0.0%、7.7%、31.9%、4.9%、0.5%,杂合子分别为占 8.2%、46.7%、37.4%、7.7%、12.6%;在对照组中,其突变型纯合子分别占 1.0%、7.4%、30.0%、2.1%、1.1%,杂合子分别为占11.1%、41.6%、32.1%、3.7%、10.5%。在基因多态性位点与肺结核发病的单因素非条件Logistic回归分析中,TaqⅠ、P52、P54的纯合子突变率低,与杂合子型合并分析。P57位点突变率不足1%,未进行分析。以野生型为参照,未发现VDR基因 TaqⅠ、ApaⅠ、FokⅠ位点和MBP基因P54位点多态性在病例组和对照组的分布差异无统计学意义。仅P52位点的多态性与肺结核的发生有关(β=0.856,S.E=0.382,Wald χ2=5.011,P=0.025,OR=2.354,95%CI为:1.112～4.981)。多因素非条件 Logistic回归分析结果显示控制了上述5个变量的协同作用后,MBP基因P52位点多态性仍然与肺结核的发生有关(β=0.845,S.E=0.395,Wald χ2=4.582,P=0.032,OR=2.329,95%CI为:1.074～ 5.050),未发现VDR和其他MBP基因位点多态性与肺结核的发生相关。

为了探讨VDR和MBP基因各位点基因型不同组合对肺结核发生危险性的影响分析,本文应用多因素Logistic回归软件对这5个基因位点的不同组合进行了交互作用分析,3个及以上位点的组合分析均未见交互作用,两两基因位点间的交互作用结果见表1,同时对有交互作用的位点进行叉生分析,结果见表2。

表2 VDR和M BP基因相关位点多态性的叉生分析

结果显示,VDR基因FokⅠ与 ApaⅠ、FokⅠ与MBP基因P52位点多态性之间的交互作用有统计学意义,但是,两个基因间3、4、5个位点多态性之间的交互作用无统计学意义。以FokⅠ野生基因型FF为参照,FokⅠ杂合子携带者与ApaⅠ杂合子之间表现为相乘作用,对ApaⅠ杂合子与结核病之间的联系具有增强作用,危险性提高2.5倍。但P52基因Ct+tt与FokⅠ基因Ff之间的叉生分析没有发现进一步的联系。

3 讨 论

VDR和MBP均是体内重要的细胞因子,活性水平在人群中分布不均[5],其基因多态性与机体的感染和炎症有关[6]。而肺结核作为一种慢性感染性疾病,影响其发病的因素很多,但主要归结为环境因素和遗传因素2大类。本研究发现肺结核患者接触史、卡介苗接种史、卡痕、重体力劳动、结核病家族史与肺结核的发病有关,与国内外相关研究结论大体一致。

在单一基因位点突变研究中仅发现P52位点突变基因型携带者发生肺结核的危险性高于野生型基因携带者,提示MBP基因突变可影响巨噬细胞吞噬结核杆菌的活性[7],导致宿主淋巴细胞对结核菌素的反应性下降[8]。但不同种族的基因型特征存在明显的差异,在非洲[9]、印度[10-11]的研究就得出了3种截然相反的结论。本研究没有发现唐山地区汉族人VDR基因的FokⅠ、ApaⅠ和TaqⅠ位点突变与肺结核的关联,提示这些易感基因型单独存在时并不能增加肺结核的患病风险。这与刘玮等[12-13]在中国的汉族军人和藏族人群中研究的结论不同;而与南非、西非、秘鲁和居住在伦敦的印度人等地的研究结论一致[14-18]。

各研究结果之间的这种差异反映出结核病的易感性不是单一基因多态性所决定的,可能与地区、环境因素以及人种的不同相关联,也可能与各独立研究的样本量较少有关。某个基因位点的变异对最终导致肺结核的发生影响有限,所以也不难理解VDR基因多态性与肺结核无关的结论。

肺结核的发生与发展是多因素介入涉及多个基因改变多步骤的过程,多种“易感”基因型同时存在可能大幅度增加或降低肺结核发生的危险性。单个细胞因子基因多态性的研究常常会有不一致的结果,或者没有显示出与疾病发生的关联性。肺结核发生全过程的多基因模型研究,比单个基因研究对个体易感性有更准确地评价,但迄今为止,国外为数不多的多基因模型研究尚无确切的结论和通用的模式。国内单个细胞因子基因多态性与肺结核关系的报道,结论尚不一致,多基因联合分析至今尚未见报道。本研究发现MBP基因P52位点与VDR基因的FokⅠ位点之间、VDR基因的FokⅠ与 ApaⅠ位点之间存在交互作用。同时携带FokⅠ杂合子和ApaⅠ杂合子者发生肺结核的危险性是单一ApaⅠ杂合子携带者的3.5倍。叉生分析未能证实MBP基因P52突变型与VDR基因的FokⅠ突变型杂合子的交互作用大小和方向,可能是P52位点突变率较低,需要较大的样本量来证实。因此,目前对基因与基因交互作用机制和生物学机制的研究样本量往往有限,分析结果的敏感性和把握度有待提高。

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