胃癌组织 Survivin和 Ki-67表达与体外化疗药物敏感性的关系

刘学军,檀碧波,吴胜春,韩 杰

化疗是胃癌综合治疗的重要措施,而肿瘤多药耐药性(multidrug resistance,MDR)的存在常导致化疗失败。因此,预测胃癌细胞的化疗敏感性具有重要意义。有研究表明,化疗敏感性与肿瘤细胞的增殖和凋亡有关[1-5],而目前关于胃癌细胞增殖、凋亡相关因子表达与化疗药物敏感性关系的临床研究少有报道。因此,本研究探讨了凋亡抑制蛋白 Survivin和反映增殖水平的 Ki-67与胃癌细胞体外化疗敏感性的关系及意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 标本取自2006年 10月—2007年12月在我院手术并经病理证实的 64例胃癌患者的新鲜肿瘤组织。64例胃癌患者中男 35例,女 29例,年龄 45～77岁,平均 (65.7±9.0)岁。术前均未接受任何治疗。术中分别取新鲜肿瘤组织1.0 cm×0.5 cm×0.5 cm置入双抗 (青霉素 G钠 100 U/ml、链霉素 200μg/ml)培养液行MTT法体外肿瘤细胞化疗药物敏感性实验。另每例肿瘤标本经中性甲醛溶液固定,常规石蜡包埋、切片行免疫组化染色。

1.2 方法

1.2.1 免疫组化染色测定 Survivin、Ki-67蛋白表达 鼠抗人 Survivin、Ki-67单克隆抗体及免疫组化试剂盒均购自北京中杉生物技术公司 (美国 Zymed公司产品),采用 SP法分别对肿瘤组织进行免疫组化染色,观察 Survivin、Ki-67蛋白表达情况,染色步骤严格按试剂盒说明书进行操作。用 PBS代替一抗做阴性对照,用已知阳性切片做阳性对照。由两位病理医师分别双盲阅片进行结果判断。每张切片随机取 5个高倍(×400)视野,每视野计数 100个细胞,Survivin以细胞膜及(或)细胞质、Ki-67以细胞核呈黄色着色为染色阳性,按肿瘤细胞着色强度和阳性细胞率分别进行记分。着色强度记分:无着色为 0分,淡黄色为 1分,黄色为 2分,棕黄色为 3分。肿瘤细胞阳性细胞率记分标准:阳性细胞≤5%为 0分,6%～25%为 1分,26%～50%为 2分,51% ～75%为 3分, ≥76%为 4分;两种记分标准所得分值的乘积为:0～1表示阴性(-),2～3为弱阳性 (+),4～7为阳性 (++),≥8为强阳性 (+++)。表达强度标准:记分≤3为弱表达,≥4为强表达。

1.2.2 体外药物敏感实验 (1)所用试剂和仪器:MTT(Sigma公司)、DMEM培养基及胰蛋白酶 (Gibco公司)、DNM-9602A酶标仪 (北京普朗公司产品)、细胞培养板(ZL03236962.X,泰伦生物公司专利产品)。 (2)实验步骤:胃癌组织经研磨分散,用细胞分离器调细胞浓度为 5×105/ml。使用前将肿瘤药敏检测板和 DMEM培养基预温至 37℃。9种受试药物为 5-氟尿嘧啶 (5-FU)、长春新碱 (VCR)、足叶乙甙 (VP-16)、紫杉醇 (PTX)、表阿霉素 (eADM)、羟基喜树碱 (OPT)、奥沙利铂 (L-OHP)、顺铂 (DDP)、甲氨蝶呤 (MTX),药物终浓度为血浆峰值药物浓度[6]。接种细胞悬液 200μl/孔,微量振荡器振荡混匀,置于 37℃、5%二氧化碳 (CO2)饱和湿度的培养箱培养 48 h,加 MTT(5 mg/ml)20μl/孔,继续培养 3～24 h,终止培养时间依据显微镜下观察 MTT被还原成蓝色针状结晶。将细胞培养板 1 000 r/min离心 10 min,弃上清液,吸水纸吸去残留液体。加入二甲基亚枫 (DMSO)100μl/孔,轻轻振荡混匀,酶标仪 570 nm测各孔吸光度 (A)值。药物对肿瘤细胞平均抑制率 (IR)=(1-给药孔平均 A值 /对照孔平均 A值)×100%。

1.3 统计学方法 实验数据用 SPSS 13.0统计分析软件分析。Survivin与 Ki-67相关性采用 Spearman相关分析,药物对肿瘤细胞的抑制率以 (x±s)表示,组间比较采用 t检验。以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织中 Survivin、Ki-67蛋白的表达 64例胃癌患者的癌组织中 Survivin、Ki-67阳性表达率分别为 90.6%(58/64)、76.6%(49/64);强表达率分别为 62.5%(40/64)、65.6%(42/64)。经 Spearman等级相关分析显示,Survivin与 Ki-67的表达呈正相关 (r=0.6354,P＜0.01)。

2.2 胃癌组织中 Survivin、Ki-67表达与化疗药物敏感性的关系 Survivin强表达时,eADM、DDP对肿瘤细胞的抑制率明显降低 (P=0.013、P=0.042),但 L-OHP对肿瘤细胞的抑制率则明显增加 (P=0.037);Ki-67强表达组中,5-FU、OPT对肿瘤细胞的抑制率明显高于弱表达组 (P=0.003、P=0.040),而 eADM对肿瘤细胞的抑制率明显降低 (P=0.001,见表 1)。

表 1 胃癌组织中 Survivin、Ki-67表达与化疗药物抑制率的关系 (x±s,%)Table 1 Relationship between expression of Survivin,Ki-67 and chemosensitivities in gastric carcinoma

3 讨论

增殖和凋亡失调在肿瘤的演进过程中是普遍存在且密切相关的现象,Survivin与 Ki-67是反映肿瘤细胞凋亡和增殖情况的重要指标。Survivin是目前已知功能最强的凋亡抑制蛋白,可通过抑制末端效应分子 Caspase阻止细胞凋亡[7-8],导致MDR的发生;而 Ki67是目前应用最广泛、能准确反映增殖活性的指标,肿瘤增殖状态与化疗敏感性密切相关[1]。已有研究提示肿瘤细胞 Survivin与 Ki67表达存在正相关性[9-10],本研究也显示胃癌组织中 Survivin与 Ki67的表达呈正相关关系,说明胃癌细胞的凋亡和增殖水平可能通过某些共同的调控机制而达到平衡,其具体机制尚待进一步研究。

肿瘤 MDR是多种基因/蛋白网络化调节的最终结果,增殖和凋亡相关蛋白在其中发挥重要作用[2-3,11]。多数胃癌化疗药物通过损伤 DNA、诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖而发挥抗肿瘤作用。本研究中有 5/9种药物的耐药与 Survivin、Ki67之一过表达有关,其中 eADM的耐药与两者均有相关性,表明Survivin、Ki67可能在这些药物作用靶点后抑制肿瘤细胞凋亡或促进肿瘤细胞增殖而产生 MDR表型;肿瘤对 eADM耐药与Survivin、Ki67共表达有关,Survivin和 Ki67具有协同抑制凋亡、促进增殖而参与肿瘤 MDR产生的作用。本研究也显示尚有 4种药物的耐药与 Survivin、Ki67的表达程度无关,说明Survivin、Ki67可能仅是决定化疗敏感性的因素之一,肿瘤细胞对 VCR、VP-16、PTX、MTX耐药可能涉及 MDR1/P-gp、GST-π、ToPo等其他 MDR途径。本研究还发现,L-OHP对Survivin过表达的肿瘤细胞抑制率明显增加,说明了胃癌 MDR的复杂性,其具体机制尚待进一步研究。

本研究初步证实了胃癌组织 Survivin、Ki67表达与部分化疗药物的耐药性有关,测定 Survivin、Ki67表达程度对预测胃癌 MDR及化疗药物敏感性具有一定意义。但胃癌 MDR是由多种耐药相关因子通过复杂的网络化调节而形成的,增殖和凋亡情况仅反映了其中部分机制,对胃癌 MDR进行分析时应综合考虑其他多种因素。

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