玻璃体腔注射对裸小鼠视网膜组织形态学的影响

刘 茜，黎韦华，黄 冰，李永平，林少春，黄健发，徐晓平，孙雪荣，陈梦飞，陈系古，廖秀珍

(中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室，广州 510060)

研究报告

玻璃体腔注射对裸小鼠视网膜组织形态学的影响

刘 茜，黎韦华，黄 冰，李永平，林少春，黄健发，徐晓平，孙雪荣，陈梦飞，陈系古，廖秀珍

(中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室，广州 510060)

目的 观察单纯的玻璃体腔注射对裸小鼠视网膜组织形态学的影响，为建立简单的制作视神经损伤动物模型奠定实验基础。方法在全身麻醉配合眼部局部麻醉情况下，利用微量注射器往裸小鼠玻璃体腔内迅速注入10 μL生理盐水，然后在不同的时间点取注射眼进行固定、切片和 HE染色，观察视网膜特别是视神经节细胞的变化。结果正常对照组视网膜层次清晰，各层排列整齐而致密，视网膜神经节细胞呈单层排列，大小不一，染色质分布均匀。实验组于注射后第1天、第3天和第5天视网膜神经节细胞减少的情况不明显，十层结构仍相对清晰。但于第7天，视网膜神经节细胞出现细胞明显缺失的现象，第14天为最严重，第30天和第60天与第14天相比无明显差别。结论玻璃体腔注射过量的生理盐水能够损伤视网膜组织，造成神经节细胞减少，有可能成为一种简单的制作视神经损伤动物模型的方法。

视神经损伤;裸小鼠;模型，动物;玻璃体腔注射

视网膜组织是视神经的一部分，属于中枢神经系统。视神经损伤多并发于颅脑损伤，亦可由于各种疾病如青光眼、炎症、眼外伤、局部缺血和肿瘤压迫等引起，严重者最终可导致失明。其发生的机制是由于视神经节细胞(retinal ganglion cell，RGCs)的凋亡，从而导致视功能的减退和一系列的视功能障碍。加强对视神经损伤发病机制和病理变化的研究，有助于了解和明确损伤视神经的再生、修复情况。而这又必须要有良好的视神经损伤动物模型作为基础。现有报道的制作这类动物模型的方法都比较耗时耗力。为此，本研究小组根据以往的实验经验，采取玻璃体腔注射过量生理盐水的方法，造成裸小鼠短暂性急性高眼压，观察视网膜组织在这种情况下损伤的情况。为建立一种简单易行的制作视神经损伤动物模型的方法奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物、试剂与仪器

SPF级裸小鼠48只，周龄4～6周，体重16～21 g;由广州中医药大学实验动物中心提供［SCXK (粤)2008－0020，粤鉴证字2008A004］;中山眼科中心眼科学实验动物中心SPF级动物实验室饲养，昼夜比 12 h:12 h，温度 23℃ ～25℃，湿度 50% ～60%。手术及饲养过程符合中山眼科中心动物伦理委员会要求。

混合固定液:福尔马林200 mL、冰醋酸100 mL 95%、酒精1000 mL、蒸馏水700 mL(广州化学试剂厂)。4.3%水合氯醛(中山眼科中心药剂科)，利多卡因滴眼液(上海禾丰制药有限公司)，微量注射器(100 μL)(生工生物工程有限公司)，普通荧光显微镜(德国Zeiss公司)。

1.2 动物分组

将动物分正常组和实验组。实验组又按照时间点(注射后第1，3，5，7，14，30，60天)分为7个亚组。正常组为未作任何处理裸小鼠。动物随机分配，每组6只动物。

1.3 动物模型的制作

裸小鼠按430 mg/kg腹腔注射4.3%水合氯醛，麻醉成功后用妥布霉素眼药水行双眼抗菌滴药，10 min后用利多卡因眼药水行注射眼局部麻醉，然后将裸小鼠固定在体式显微镜下。用眼科镊挣开眼睑，充分暴露眼球，用微量注射器由角巩膜缘15°斜向下进针入玻璃体腔，快速注射入10 μL生理盐水。进针时注意避开晶体。退针时要快速准确，注意不要损伤周围组织。行单眼注射。注射完毕，若眼球能明显胀大鼓起，即判断为造模成功，入选为实验观察用;若注射完毕，眼球萎缩，即判断为造模失败，淘汰，不用于实验观察。玻璃体腔注射后三天内滴用妥布霉素眼药水，一天三次，防止炎症反应的发生。

1.4 标本制作

于玻璃体腔注射后第1、3、5、7、14、30和60天取注射侧眼球;取出后在角膜上打一小孔，然后用混合固定液固定2 h，再用4%多聚甲醛4℃固定24 h;这时视网膜基本固定好，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，沿矢状线方向全层切片眼球，片厚4 μm，HE染色。

1.5 HE染色及神经节细胞计数

切片常规HE染色，中性树胶封片。光学显微镜下观察视网膜的形态学变化。采用单盲法进行视网膜神经节细胞的计数。计数每个400倍光镜视野中视网膜神经节细胞的个数，取5个视野，计算平均视网膜神经节细胞数。采用SPSS16.0统计分析软件作方差分析检验。根据视网膜神经节细胞数量的变化定量视神经节细胞损伤程度。

2 结果

2.1 视网膜HE染色形态学观察(图1见彩插4)

正常对照组视网膜层次清晰，各层排列整齐而致密，视网膜神经节细胞呈单层排列，大小不一，轮廓不规则，细胞核大小不一，染色质分布均匀。从核形态学上可明确分为两类:一类大而浅染，胞核有时可见核仁;另一类小而深染。可见少量呈新月形的血管内皮细胞分布于毛细血管内表面(图1A)。注射后第1、3和5天视网膜神经节细胞缺失并不明显，视网膜组织层次相对清晰(图1B，C，D)。注射后7 d视网膜神经节细胞出现缺失现象(图1E)。14 d时最明显，细胞核大而浅染，胞核明显稀疏，大而浅染的细胞核明显减少，甚至消失，小而深染的细胞核相对减少较轻，内、外核层细胞变化不明显 (图1F)。注射后第30和60天时视网膜神经节细胞缺失速度减慢，损伤情况与 14 d相似(图1G，H)。

2.2 视网膜神经节细胞计数

视网膜神经节细胞数目的变化与形态学观察的结果相一致。实验组与正常对照组比较，注射后1 d、3 d、5 d和 7 d神经节细胞减少不明显(P＞0.05)，注射后14 d、30 d和60 d神经节细胞显著减少(P＜0.01);另外，统计学分析得出第1、3、5天相邻两组间差异不显著(P＞0.05);注射后第7、14、30、60天各组间也无显著性差异(P＞0.05)(表1)。

表1 不同时间点视网膜神经节细胞(RGCs)计数(±s)Tab.1 Retinal ganglion cell(RGCs)number counting at different time intervals(±s)

表1 不同时间点视网膜神经节细胞(RGCs)计数(±s)Tab.1 Retinal ganglion cell(RGCs)number counting at different time intervals(±s)

注:*:显著性差异(P＜0.05)。Note:*:Significant difference(P＜0.05).

组别 正常组1d 3d 5d 7d 14d 30 d 60 d Groups Normal 1d 3d 5d 7d 14d 30d 60 d 41.50±4.95 36.50±0.70 39.67±2.31 37.33±9.07 25.75±11.87*16.50±3.42*20.33±5.51*18.25±5.32*

3 讨论

如何预防致盲性眼病的发生发展，如何提高患者的视力，成为当前研究的热点。随着医疗技术的不断提高和诊疗手段的不断进步，感染性眼病和白内障等致盲性疾病得到了有效诊治。但是同时由于生活水平的提高及生活压力的不断加大，青光眼、高眼压性疾病也不断增加。这些疾病都可以导致视网膜神经节细胞损伤并最终致盲。目前这些疾病尚无有效的治疗方法。

3.1 视网膜神经节细胞损伤模型

随着时代的进步和科学研究的发展，视神经保护和损伤修复成为眼科学和神经科学的研究热点。为了对视神经的损伤机制及神经保护方法进行研究，学者们建立了不同的动物模型。目前视网膜神经节细胞损伤的动物模型，主要有高眼压动物模型和视神经损伤模型。青光眼是致盲性眼病的一种，其最终结果是视网膜神经节细胞死亡，视神经发生进行性损害，从而导致不可逆性视力丧失［1］。青光眼动物模型分为两大类:一类为非高眼压的视神经损伤模型，另一类为高眼压模型。非高眼压的视神经损伤模型主要又分为缺血再灌注模型、机械损伤模型和药物毒物损伤模型［2－4］。高眼压损伤模型主要分为急性高眼压模型和慢性高眼压模型。曾有研究者将生理盐水注入大鼠前房，引发急性高眼压导致血液供应中断，继而引发 RGCs的死亡［5］。该实验虽然简单易行，但是对于小鼠来说，其前房注射难度较高，故该模型的应用也受到限制。Morrison等［6］将高渗盐水注入 Brown Norway大鼠巩膜上静脉，导致小梁网硬化，继而导致持续性眼压升高，引起视神经损害。此方法制作动物模型的缺点是操作较复杂，需要注射高渗盐水用的特殊精细管，且需重复注射。Ueda等［7］用印度蓝注入前房，碳离子堆积在前房角形成一黑色条带，在不需要前房角镜的情况下，可以黑色条带为标记激光光凝小梁网，导致眼压升高维持了4周。组织学切片也证实形成了周边虹膜前粘连，成功制作了高眼压动物模型。但激光光凝小梁网法的缺点是需多次激光光凝才能获得60%的成功率。神经元轴突的损伤，会导致轴浆运输的障碍，最终致神经元的凋亡和坏死。视神经的损伤也必然影响视网膜神经节细胞的功能，并可能跨神经元影响到视觉信号传导通路的视网膜各层，并引起视网膜功能和结构的改变。视神经结扎和夹伤模型是目前临床常见的视神经钝挫伤的实验模型。国外有实验采用10－0缝线于球后1.0 mm处结扎视神经轴突的方法建立 RGCs损伤模型的报道［8，9］。另有实验用压力恒定的反向镊于球后2 mm处夹持视神经建立视神经损伤的动物模型［10］。同时有实验运用视神经损伤模型，研究视网膜神经节细胞的变化情况，并定量分析［10］。其研究结果表明，视神经不全损伤导致了视网膜形态结构的变化，伤后7天神经节细胞明显丢失，28 d视网膜出现了萎缩，厚度变薄。但视神经损伤常常需要暴露视神经鞘膜，因此，不可避免的增加了对视神经的牵拉和对眼球后极部血管的损伤，使得 RGCs损伤因素变得复杂。同时，也有研究运用RNA干扰技术，干扰酪氨酸酶，为体内酪氨酸缺失所致的视网膜神经节细胞的损伤模型奠定了基础［11］。

综上所述，为了方便青光眼等因素所引发的视神经损伤性疾病的发病机制及治疗方法的研究，有必要建立一种简单，可重复的方法制作动物模型。另外，由于裸小鼠免疫学方面特点，其视网膜神经节细胞损伤模型，能够为异种细胞移植的体内实验奠定基础，其眼部所需细胞治疗量亦较大鼠模型少。鉴于以上的研究目的和裸小鼠动物模型的应用潜力，本实验采用玻璃体腔瞬间注射大量生理盐水，于注射后第1、3、5、7、14、30、60天观察其视网膜组织和神经节细胞受损伤的情况，探讨简单的玻璃体腔注射制作裸小鼠视神经损伤模型的可行性。本实验结果提示该方法是具有可能性的。

研究过程中发现，当注入5 μL生理盐水时，小鼠的玻璃体腔肿胀的并不十分明显，当注入10 μL时，玻璃体肿胀明显，眼球鼓出眼眶，并可维持一段时间。同时，由于有文献指出，大鼠对侧未损伤的视网膜也会有胶质反应［12，13］，因此不选择对侧作为对照组，而以未处理的裸小鼠作为对照。本实验发现注射生理盐水后5 d内，RGCs数目几乎保持不变，第7天时开始出现视网膜神经节细胞的缺失。注射后7～14 d是RGCs快速减少期，并在第14天时达到高峰。之后的改变仍然朝着恶化的方向发展，但是速度有所减慢并与14 d差异不大。

3.2 RGCs缺失与注射经过时间的关系

本实验通过玻璃体腔注射过量生理盐水后2个月内多个时间点的RGCs形态学、定量观察，发现玻璃体腔注射后，尽管各时间点 RGCs下降幅度存在明显差异，但是他们的大体变化趋势是一致的。在注射后早期(1～5 d)，RGCs变化不明显，注射后7 d时RGCs出现缺失;注射后中期(7～14 d)RGCs急剧大量缺失，为快速缺失期;损伤后期(30～60 d) RGCs缺失速度减慢，开始进入平稳减速期。由本文的实验结果我们发现，视神经节细胞的缺失与注射后所致损伤的时间之间有一定的相关性，两者之间变化有一定的规律。

本实验通过玻璃体腔注射过量生理盐水入裸小鼠眼内，并定量分析了该方法对裸小鼠视网膜组织的影响及RGCs缺失程度与时间的相关性。该方法简单、易行，能够导致视网膜的损伤、神经节细胞的缺失。另外，由于裸小鼠具有 T淋巴细胞免疫缺陷的特点，制作的动物模型更方便异体细胞的体内移植研究。本实验为急性高眼压所致的视神经节细胞损伤分子机制及视神经保护性治疗的深入研究提供了实验基础。

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The Impact of Intravitreal Injection on the Retina Morphology in Nude Mouse

LIU Qian，LI Wei－hua，HUANG Bing，LI Yong－ping，LIN Shao－chun，HUANG Jian－fa，XU Xiao－ping，SUN Xue－rong，CHEN Meng－fei，CHEN Xi－gu，LIAO Xiu－zhen
(State Key Laboratory of Ophthalmology，Zhongshan Ophthalmic Center，Sun Yat－sen University，Guangzhou 510060，China)

ObjectiveTo observe the impact of intravitreal injection on the retina morphology in nude mouse and to provide the experimental basis for the establishment of optic nerve injury animal model。MethodsUnder general anesthesia combined with optic local anesthesia，10 μL normal saline was quickly injected into the vitreous chamber with micro－syringe，resulting in short－term acute high intraocular pressure.Then the injected eyeballs were sampled，fixed，sliced and HE stained at different time points.Then，the morphological changes of the retina，ganglion cells in particular were observed。ResultsThe normal retinal cells presented clear layers and each layer was arranged regularly and tightly. The ganglion cells were arranged in monolayer pattern and had different sizes from each other，and the chromatin was distributed evenly.After intravitreal injection，the retinal ganglion cells were not significantly decreased at the first，the third and the fifth day.The ten layers of retina were still relatively clear.However，on the seventh day，the retinal ganglion cells lay showed marked cell loss，which was most serious on the fourteenth day.After that day the decreasing speed was decreased.The thirtieth and sixtieth days were not significantly different from the fourteenth day。Conclusions Intravitreal injection of overdose normal saline is likely to induce short－term acute high intraocular pressure and damage the retinaltissue，resulting in the reduction of ganglion cells.It is expected to become a simple method to establish the animal model of optic nerve injury.

Optic nerve damage;Nude mouse;Model，animal;Intravitreal injection

Q95－33

A

1671－7856(2010)07－0032－04

2010－03－02

广东省科技计划项目(2008A060202008)。

［基金项目］刘茜(1982—)，女，硕士，研究方向:视神经保护。E－mail:jiuer790@yahoo.com.cn

黄冰，副研究员。E－mail:huangbing2000@hotmail.com