人源化小鼠人源细胞检测方法

陈 炜，冯 娟，施海霞，梁 虹，张连峰

(中国医学科学院实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心 卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

技术方法

人源化小鼠人源细胞检测方法

陈 炜，冯 娟，施海霞，梁 虹，张连峰

(中国医学科学院实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心 卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

目的 人源化小鼠在人类疾病与再生医学研究中具有广泛应用，为获得一种理想的人源化小鼠检测方法，研究人特异性线粒体序列扩增作为人源化动物模型中人类DNA检测方法的可行性。方法设计人线粒体DNA特异性引物，并用该引物对人脐血造血干细胞嵌合体小鼠进行了检测。结果在人源化动物模型的人类DNA检测中，这种人线粒体DNA的PCR检测方法能够达到理想的特异性与灵敏性，是一种理想的嵌合体小鼠检测方法。结论获得了一种理想的人源化小鼠人源细胞检测方法。

人源化小鼠;脐血干细胞;线粒体DNA

显微注射法制备嵌合体动物的方法最早出现在1968年，Gardner［1］报道将小鼠囊胚内细胞团细胞显微注射到另一种毛色的小鼠囊胚中后，获得毛色混合的嵌合体小鼠。Harder等［2，3］将人脐血造血干细胞注射到小鼠囊胚中后，从小鼠造血系统中检测到人源化细胞嵌合。人源化小鼠的出现为在活体内进行人类生物学研究提供了可能，人源化嵌合体动物研究的发展需要一种简便易行、且灵敏度较高的人源化细胞基因检测技术。

动物线粒体DNA(mitochondria DNA，mtDNA)是一种共价闭合、环状双链DNA分子，线粒体DNA为多拷贝基因，每个细胞器含有数个到上千个不等的线粒体，而每个线粒体可含有数个到数十个不等的线粒体DNA分子，除卵母细胞外，普通细胞中的线粒体DNA基因组可以高达一万个［4］。因此，本研究将利用 mtDNA的高拷贝特性，研究人特异性mtDNA保守序列PCR扩增作为人源化动物模型中人类DNA检测方法的可行性。

1 材料和方法

1.1 人造血干祖细胞制备

正常健康新生儿脐血由北京市脐带血造血干细胞库提供(孕母排除病毒性肝炎、艾滋病和梅毒感染)。Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞液 (密度1.077)，购自GE Healthcare;EasySep负选人造血干祖细胞(含CD41)试剂盒和EasySep magnet购自加拿大stemcell公司。脐血用肝素钠抗凝，12 h内分选。用Ficoll Paque PLUS淋巴细胞分离液以不连续密度梯度离心，收集界面白膜层悬浮细胞即为脐血单个核细胞(MNC)，MNC再经EasySep负选人造血干祖细胞试剂盒分选获得人造血干祖细胞。

1.2 囊胚供体鼠与显微注射

用3～4周龄 ICR雌鼠作为囊胚供体鼠。采用PMSG和 hCG间隔48 h腹腔注射促排卵。hCG注射后与 ICR雄鼠合笼。次日早晨检查阴栓，见栓当天为受精0.5 d。第2.5天取桑椹胚，KSOM液培养过夜，至次日囊胚充分扩张后进行造血干细胞的显微注射，每个囊胚内注射15～20枚造血干细胞。

1.3 结扎雄鼠和假孕鼠的准备

取6周 左右 ICR雄鼠，双侧输精管结扎，手术后恢复3～4周，与雌鼠交配，连续 3次见栓且未引起雌鼠妊娠的作为假孕交配用结扎雄鼠。取正常6～8周 以上 ICR雌鼠与结扎雄鼠交配，作为假孕母鼠。将显微注射后重新扩张的囊胚移植到假孕鼠2.5 d子宫中。

1.4 人源化嵌合体的PCR鉴定

人DNA梯度稀释实验中，在小鼠DNA中依次添加0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、5%和10%的人类DNA。子代小鼠出生后计数小鼠个数，9～14 d剪尾，裂解组织提取DNA，分别用下列引物进行嵌合体小鼠的PCR检测。人线粒体DNA特异性引物hmtDNA-FP:5′CAC CCT ATT AAC CAC TCA CG 3′;hmtDNA-RP:5′-ATG TCT GTG TGG AAA GCG-3′，扩增产物大小为264 bp。小鼠与人线粒体DNA通用引物序列mtDNA-FP:5′-GGA TTA GAT ACC CCA CTA TGC-3′;mtDNA-RP:5′-GCT ACA CCT TGA CCT AAC GT-3′，PCR产物大小为 268/ 273 bp(人/小鼠)。hAlu-FP:5′-CTG GGC GAC AGA ACG AGA TTC TAT-3′;hAlu-RP:5′-CTC ACT ACT TGG TGA CAG GT TCA-3′，PCR产物大小224 bp。反应条件:预变性 94℃ 3 min，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，人 DNA梯度稀释实验中PCR循环数为25个循环，嵌合体小鼠检测PCR实验中共40个循环。hAlu PCR扩增条件参照Kaneko等［5］，94℃变性30 s，60℃退火30s，72℃延伸30 s，扩增结束后，72℃延伸 10 min，1%琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外透射仪下分析结果。

2 结果

2.1 人类特异性mtDNA序列和PCR引物的确定

利用DNAMAN序列分析软件，对人类mtDNA (GI:17981852)和小鼠mtDNA(GI:118200767)的序列进行比对，发现下列对应片段的序列同源性仅为34.97%(图1)，且通过NCBI blast分析表明该人类mtDNA片段在小鼠基因组中无同源序列。

本研究针对这段特异性序列设计了人线粒体DNA特异性引物。同时针对小鼠与人类线粒体DNA同源序列设计了一对通用引物作为内参对照引物。分别采用人线粒体DNA特异性引物和人鼠线粒体DNA通用引物对梯度稀释的人 DNA进行PCR扩增，结果表明PCR循环数为25个循环时，电泳条带的亮度随样本中人DNA含量的增加而增加(图2)。

2.2 人脐血造血干细胞小鼠嵌合体的检测

分别提取出生1周、2周、4周和8周的小鼠鼠尾DNA，用hmtDNA特异性引物进行PCR扩增，在110只小鼠中检测到25只嵌合体阳性小鼠，阳性率为23%。图3为其中一只嵌合体小鼠的PCR检测结果。

2.3 hmtDNA PCR检测与hAlu序列PCR检测的灵敏度比较

分别采用hmtDNA和hAlu引物对嵌合体小鼠DNA进行检测，结果表明hmtDNA引物PCR检测的特异性与灵敏性均比hAlu引物更理想(图4)。

3 讨论

由于人类Alu基因序列的高度物种特异性和可重复性，Alu基因特异性引物被许多研究者用于混合物种样本中人DNA的鉴定。如McKenzie等［6］首次用32P标记 Alu探针检测人鼠混合样本中的人DNA的存在。Zubair等［7］采用Alu引物分析注射人淋巴癌细胞的小鼠组织中的人源化细胞数，但只有当每μg小鼠DNA中的人DNA量达到1～10 ng水平时才能检测。Kim等［8］的方法能够检测出 2× 106鸡细胞中的一个人类细胞，但反应体系中采用了32P标记dCTP，且在电泳后还需要对PCR条带进行密度扫描。Schneider等［9］以 Alu基因为模板进行定量PCR，能够检测中1×106个小鼠细胞中的一个人类细胞，该方法在检测技术上有了显著改进，但由于费用较昂贵，且需要 LightCycler实时定量PCR系统，尚不能满足常规嵌合体基因型检测的需要。

图1 人类和小鼠mtDNA部分序列的比对结果Fig.1 Sequence alignment of Homo sapiens and Mus musculus mitochondrion

图2 梯度稀释人DNA的 PCR鉴定Fig.2 Genotyping of human genomic DNA with PCR

图3 人脐血造血干细胞—嵌合体小鼠DNA的PCR鉴定Fig.3 Genotyping of human umbilical cord blood-derived cells in human-mouse chimeras DNA with PCR

图4 hmtDNA与hAlu引物扩增效果比较Fig.4 Comparison of PCR amplification in human-mouse chimeras genomic DNA with PCR

哺乳动物mtDNA全长16.5 kb左右，定位2种rRNA、22种参与线粒体蛋白合成的tRNA和13种涉及呼吸作用和氧化磷酸化功能的多肽链基因。具有分子结构简单、编码效率高、拷贝数多、进化速率快和严格的母系遗传等共同特性。本研究利用mtDNA的高拷贝特性，用人特异性mtDNA保守序列PCR扩增作为人源化动物模型中人类DNA检测方法。结果表明，在人源化动物模型的人类DNA检测中，这种线粒体DNA的PCR检测方法的特异性与灵敏性均比hAlu更理想。

以往研究表明，恒河猴 MSCs可以在 ICR小鼠胚泡内存活［10］，并且在体外可以随囊胚孵出。用人脐血造血干细胞进行小鼠囊胚显微注射也得到了相同的结论［2，3］。这说明灵长类成体干细胞可以在小鼠胚胎中生长发育。本研究发现在人源化小鼠出生后8周时仍可检测人源化细胞的存在。

［1］ Gardner RL.Mouse chimaeras obtained by the injection of cells in to the blastocyst［J］.Nature，1968，220(167):596－597.

［2］ Harder F，Henschler R，Junghahn I，et al.Human hematopoies is in murine embryos after injecting human cord blood derived hematopoietie stem cells into murine blastocysts［J］.Blood，2002，99(2):719－721.

［3］ Harder F，Kirchhof N，Petrovic S，et al.Developmental potentials of hematopoietic and neural stem cells following injection into preimplantation blastocysts［J］.Ann Hematol，2002，81(Suppl2): S20－S21.

［4］ King MP，Attardi G.Human cells lacking mtDNA:repopulation with exogenous mitochondria by complementation［J］.Science，1989，246:500－503.

［5］ Kaneko S，Nagasawa T，Nakauchi H，et al.An in vivo assay for retrovirally transduced human peripheral T lymphocytes using nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency mice［J］. Exp Hematol，2005，33:35－41.

［6］ McKenzie BA，Barrieux A，Varki NM.A novel detection system for submicroscopic human metastasis in athymic mice［J］.Cancer Commun，1991，3(1):15－19.

［7］ Zubair AC，Ali SA，Rees RC，et al.Investigation of the effect of BB-94(batimastat)on the colonization potential of human lymphoma cells in SCID mice［J］.Cancer Lett，1996，107(1): 91－95.

［8］ Kim J，Yu W，Kovalski K，et al.Requirement for speci?c proteases in cancer cell intravasation as revealed by a novel semiquantitative PCR-based assay［J］.Cell，1998，94(3):353－362.

［9］ Schneider T，Osl F，Friess T，et al.Quantification of human Alu sequences by real-time PCR– an improved method to measure therapeutic efficacy of anti-metastatic drugs in human xenotransplants［J］.Clin Exp Metastasis，2002，19:571－582.

［10］ 迟晓春，陈曦，杨京京，等.显微注射技术的改进和用灵长类间充质干细胞制备嵌合体小鼠［J］.解剖学杂志，2004，27 (2):207－209.

Detection Method for Humanized Cells in Human-mouse Chimeras

CHEN Wei，FENG Juan，SHI Hai-xia，LIANG Hong，ZHANG Lian-Feng
(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences＆Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

ObjectiveTo extensively analyze the genotyping methodology for human-mouse chimeras，which is mandatory for research on regenerative medicine and some human diseases，a feasibility study was conducted to find out if amplification of human specific mitochondrial sequences could be applied to accurately and sensitively quantify of human genomic DNA in humanized animal model。MethodsThe primers of amplification of human specific mitochondrial sequences was designed and used to amplificate the humanized cells in human umbilical cord blood-derived cells-mouse chimeras。ResultsThese results demonstrated that this new approach provided the necessary level of specificity and sensitivity。ConclusionThis method comprises a simple and reliable assay system for studies of human-mouse chimeras.

Human-mouse chimeras;Human umbilical cord blood-derived cells;Mitochondria DNA(mtDNA)

R-33

B

1671-7856(2010)07-0063-04

2010-05-10

国家科技重大专项“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”(2009ZX10004-307)。

张连峰。E-mail:zhanglianfeng@cnilas.pumc.edu.cn

梁虹。E-mail:lianghong5@gmail.com