冷拘束应激对大鼠心脏和肝脏HSP70表达及血清中CK、ALT含量的影响

包晶莹，林飞燕，王一龙，黄卡特，朱加银，林婷婷，吴 军，方周溪，吴步猛

(1.温州医学院生命科学学院，温州 325035;2.温州医学院实验动物中心，温州 325035; 3.温州医学院附属第一医院病理科，温州 325000;4.温州医学院电镜室，温州 325035)

研究报告

冷拘束应激对大鼠心脏和肝脏HSP70表达及血清中CK、ALT含量的影响

包晶莹1，林飞燕1，王一龙2，黄卡特3，朱加银2，林婷婷1，吴 军1，方周溪4，吴步猛2

(1.温州医学院生命科学学院，温州 325035;2.温州医学院实验动物中心，温州 325035; 3.温州医学院附属第一医院病理科，温州 325000;4.温州医学院电镜室，温州 325035)

目的通过研究冷拘束应激中大鼠心脏和肝脏组织热休克蛋白(HSP70)表达量以及血清中肌酸激酶(CK)、谷丙转氨酶(ALT)含量的变化，探讨冷拘束应激对心脏和肝脏的影响和差异。方法选取50日龄清洁级大鼠77只，随机分为7组，即0 h，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，3.0 h。采用拘束冷应激法，应激相应时间后，用免疫组织化学方法观察大鼠心脏和肝脏组织 HSP70的表达，并检测血清中CK和ALT含量。结果(1)心脏中HSP70表达量随着应激时间的延长而增加，1.5 h组较0 h组有明显的增加(P＜0.05)，而2.0 h后有极明显的增加(P＜0.01)。(2)肝脏中HSP70表达量随应激时间的延长呈缓慢增加，仅3.0 h组有较明显的增加，与0 h组、0.5 h组及1.0 h组比较有显著差异(P＜0.05)。(3)应激开始阶段大鼠血清中的CK含量迅速上升，之后平缓升高;大鼠血清中的ALT含量呈现上升趋势，2.5 h以前上升较平缓，2.5 h以后急骤升高。结论冷拘束应激可使大鼠心脏中HSP70的表达量和血清中CK含量在较短的时间内显著上升，且随着时间的增加而递增，而肝脏中HSP70的表达量和血清中ALT含量在较短的时间内无明显变化，只有在3.0 h时才显著增加，提示心脏对冷拘束应激较敏感，而肝脏对冷拘束应激有较强的耐受性。

冷拘束应激;心脏;肝脏;热休克蛋白;肌酸激酶;谷丙转氨酶

冷应激是低温作业、突发自然灾害、军事作业等寒冷环境中不可避免的一种应激因素，对人机体可产生严重的损害，冷应激发生的机制几乎涉及所有的器官和系统，严重者可造成动物器官损伤，如胃溃疡、免疫功能下降等病理现象，进而危及生命。鉴于人体对寒冷的适应能力不如适应高温的能力强［1］，寒冷损伤和适应历来受到医学界高度重视，特别是军事医学、营养医学和预防医学对其研究愈来愈深入。但是目前对于冷应激对动物脏器组织的损伤差异和变化的实验研究报告较少，尤其是急性冷应激的实验。肌酸激酶(CK)是心肌细胞的损伤的主要临床依据，谷丙转氨酶(ALT)对于肝脏损伤的评价具有重要意义。近年来的研究发现，在热暴露、冷暴露和损伤等应激条件下，一组应激蛋白热休克蛋白家族(heat shock proteins，HSPs)的表达水平会显著增加，HSPs在机体内作为一种分子伴侣而对机体起到保护作用［2，3］，在一定程度上可以作为应激的指标。本实验研究在急性冷拘束应激条件下大鼠血清中CK和ALT含量以及心脏和肝脏中HSP70表达的动态变化来评价冷拘束应激对心脏和肝脏的影响和差异，同时对HSP70作为评价急性冷应激标准的可能性提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

Sprague Dawley(SD)大鼠，雄性，77只，清洁级，由温州医学院实验动物中心提供［SCXK(浙)2005－0019］，体重180～230 g。

1.2 冷拘束应激模型制作

SD大鼠正常喂养50 d后，随机分为7组，即分别冷拘束应激0 h，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h和3.0 h，每组11只。实验前大鼠禁食24 h，自由饮水，将大鼠四肢束缚于网格板上，限制其活动，置于5℃ ±1℃冰箱内急性冷应激相应时间后取出。

1.3 标本制作

将蘸有乙醚的棉球悬挂于乙醚罐中，让其挥发，然后将冷拘束应激后的大鼠投入容器内，约1 min左右即可麻醉，麻醉后应立即取出，并准备一个装着蘸有乙醚的棉球小烧杯，在大鼠麻醚变浅时给套在鼻上使其补吸麻药。实验过程中操作人员佩戴口罩和戴橡胶手套，防止乙醚的吸入以及对皮肤的损伤。每组随机各取8只开腹，腹主动脉取血、分离血清备用，另每组各取3只开腹快速取其心脏和肝脏组织各2块，每块体积约0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm，置于10%中性福尔马林中固定 24 h以上，水洗、常规脱水、石蜡包埋，连续切片5 μm备用。乙醚的麻醉的作用机制主要是抑制中枢神经系统，使肌肉松驰，本实验麻醉时间较短，并且麻醉后立即进行实验，对心脏和肝脏的影响较少。

1.4 肌酸激酶及谷丙转氨酶含量的检测

采用化学比色法测定CK和赖氏法测定ALT，试剂盒购于南京建成生物工程研究所，检测按照试剂盒说明书进行。

1.5 HSP70检测

免疫组化二步法试剂盒购自北京中杉生物技术公司。石蜡切片脱蜡水化，新鲜配制的 3% H2O2，室温下孵育10 min去除内源性过氧化物酶，0.01 nmol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)抗原热修复，滴加兔多克隆抗体 HSP70，稀释度1∶100，4℃冰箱过夜;PBS洗 2 min×3次，加二抗山羊抗兔 IgG，37℃温箱孵育30 min。PBS洗2 min×3次，DAB显色。苏木素复染，1%盐酸酒精分化，返蓝，脱水，透明，封片。实验以0 h组作为阴性对照。结果判定以细胞质或细胞核染成黄色或棕褐色为阳性判定标准。

1.6 数据采集

每张切片随机选取 10个观察区，采用 Image－Pro Plust5.1图像处理与分析系统分析免疫组化染色图像，根据HSP70阳性反应区域的面积代表每一张图片HSP70阳性表达量。其中心脏和肝脏分别选取8张和10张图片进行计算。

1.7 数据分析与统计

2 结果

2.1 心脏和肝脏中HSP70表达的光镜观察

由图1(见彩插5)可以观察，HSP70主要表达在心肌间质的小动脉和小静脉管壁上，随着应激时间的延长，表达的血管数量和强度增强;0 h组几乎无表达;0.5 h组和1.5 h组略有增强;1.5 h后增强较显著，以3.0 h组表达最强。光镜观察，肝脏组织中HSP70主要表达于汇管区小叶间动脉和小叶间静脉管壁，随着应激时间的延长表达逐渐增强;0 h到1.0 h组表达较少，且无明显变化;在1.5 h时表达略有增强;1.5 h后逐渐增加，到3.0 h时增强明显。

2.2 心脏和肝脏组织中HSP70表达量的变化

心脏中 HSP70表达量随着应激时间的延长而增加，1.5 h组、2.0 h组、2.5 h组及3.0 h组与0 h组有极明显的增加(P＜0.01);3.0 h组的 HSP70表达量与0.5 h组和1.0 h组比较也有明显的增加(P＜0.01)。肝脏中HSP70表达量随应激时间的延长呈缓慢增加，在0 h组至2.5 h组间均无显著差异(P＞0.05)，但3.0 h组HSP70表达量有较明显的增加，与0 h组有极明显的增加(P＜0.01)，与0.5 h组及1.0 h组比较有显著差异(P＜0.05)(表1)。

2.3 血清中CK和ALT含量变化

应激开始阶段大鼠血清中的 CK含量迅速上升，之后平缓升高。各实验组与0 h组比较都有极显著的升高(P＜0.01);0.5 h组与1.0 h组相比无显著性差异(P＞0.05)，但与其余各组相比较都存在极明显的差异(P＜0.01)。随着冷应激时间的延长，大鼠血清中的ALT含量呈上升趋势，2.5 h以后急骤升高。3.0 h组与0 h组比较存在极显著的差异(P＜0.01);其他组与0 h组相比不存在显著性差异(P＞0.05);0.5 h组、1.0 h组和1.5 h组与3.0 h组相比存在显著性差异(P＜0.05)(表2)。

表1 各组大鼠心脏和肝脏组织HSP70表达量的变化(n=3)Tab.1 Changes of HSP70 expression in heart and liver tissues from each group(n=3)

表2 各组血清中CK，ALT活力的比较(n=8)Tab.2 Activity of CK、ALT on serum from each group(n=8)

3 讨论

应激反应是生物体对趋于打乱其自稳状态的各种不良刺激的生物反应的总和，此代偿反应不足或不适当就会造成生物稳态的破坏。CK是细胞内酶，广泛分布于脊椎动物组织中，尤以骨骼肌、心肌等组织含量最高;应激可致细胞膜损伤，细胞破坏，CK渗漏至细胞外，使血清中CK含量增高，因此血清CK含量可以作为应激时心肌组织损伤的判定指标之一［4］。ALT分布于肝组织中，正常情况下由于细胞膜的屏障作用不易溢出，仅由于细胞的不断更新而少量释放到血中［5］;只有当细胞受到损伤，细胞膜的通透性升高，血清中的 ALT含量才会升高，所以血清中 ALT的含量是判断肝功能损伤的重要指标。HSP70几乎在所有生物的应激细胞中都经常高度地被诱导表达，HSP70赋予细胞或生物体从应激状态中恢复的能力，并保护它们免受应激的损害，是对环境和代谢应激综合反应的代表［6］。在一定程度上可以作为评价应激损伤的指标。

本研究结果显示，血清中CK和ALT的浓度则随着拘束冷应激时间的增加而递增，提示大鼠心肌和肝组织可能造成损伤。程树军等［7］发现溶血可使恒河猴和 Beagle犬血浆中 CK、ALT等酶产生显著影响并随着溶血加重而升高，实验中偶见溶血现象，可能会对血清生化指标的测定产生一定的影响。

张北奇等［8］发现心肌组织对热休克、缺血等外源性应激刺激呈高敏感性，且随刺激形式的不同而产生的热休克蛋白含量也不同。本研究显示，在冷拘束应激初期心脏中 HSP70的表达量略有上升，1.5 h以后显著增加，3.0 h时心脏中 HSP70的表达量较应激初期有明显的增加。应激初期 HSP70表达量增加不明显，这可能与HSP70的合成动力学有关，即没有达到合成高峰。1.5 h以后心脏中HSP70表达量显著增加，提示此时冷应激对心脏产生了一定的损伤，诱导心脏组织产生大量的 HSP70。本研究还显示，在冷应激开始阶段大鼠血清中的 CK含量迅速上升，之后平缓升高，3 h时达到最高值，证实冷拘束应激在较短的时间内就能对心脏产生一定程度的损伤，且随着应激的持续损伤有加剧的趋势。心脏中HSP70的表达以及CK含量的变化都提示心脏对冷拘束应激具有较高的敏感性。

李鹏等［9］发现短时间的寒冷刺激并不能使肝脏的组织结构发生改变。本研究发现，肝脏中HSP70表达量随应激时间的延长呈缓慢增加，只有在3.0 h时 HSP70表达量较应激初期有明显的增加，提示短时间的急性冷应激对肝脏的影响并不很大，但是应激3.0 h后也有一定的损伤。本研究对大鼠血清中ALT含量的动态观察也显示只有3.0 h时有显著地升高，提示肝脏对拘束冷应激的反应较迟钝，但持续的拘束冷应激也可能对肝组织造成损伤。肝脏中HSP70的表达和ALT含量的变化都提示肝脏对拘束冷应激具有较强的耐受性。

综上所述，冷拘束应激可使大鼠心脏中HSP70的表达量和血清中CK含量在较短的时间内显著上升，且随着时间的增加而递增，而肝脏中 HSP70的表达量和血清中 ALT含量在较短的时间内无明显变化，只有在3.0 h时才显著增加，提示心脏对冷拘束应激较敏感，而肝脏对冷拘束应激有较强的耐受性。

［1］ Klenerova V，Jurcovicova J，Kaminsky O，et al.Combined restraint and cold stress in rats:effects on memory processing in passive avoidance task and on plasma levels of ACTH and corticosterone［J］.Behav Brain Res，2003，142(1－2):143－149.

［2］ Fujita J.Cold shock response in mammalian cells［J］.J Mol Microbiol Biotechnol，1999，1(2):243－255.

［3］ Jaattela M.Heat shock proteins as cellular lifeguards［J］.Ann Med，1999，31(4):261－271.

［4］ 吴丽丽，严灿，苏俊芳，等.丹栀逍遥散及其提取物对慢性应激大鼠下丘脑－垂体－肾上腺轴分泌的影响［J］.广州中医药大学学报，2006，23(5):413－415.

［5］ 李玉保，孙培明.运输应激猪组织病理性损伤、HSP27的组织分布及其相关性研究［J］.南京农业大学学报，2005，28 (3):83－87.

［6］ 郑磊，颜晓慧.热应激时热休克蛋白70及其细胞保护作用［J］.国外医学卫生学册，1999，26(4):209－212.

［7］ 程树军，黄韧，梁金强，等.实验动物血液中溶血因素的干扰和影响［J］.中国实验动物杂志，2002，12(1):1－4.

［8］ 张北奇，王燕凌，洪丽华，等.不同应激刺激后大鼠心脏、肝脏热休克蛋白(HSP70)的产生规律［J］.河北医药，2003，25 (8):563.

［9］ 李鹏，杨焕民，任宝波，等.冷应激大鼠几种组织形态结构变化的研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2004，16(2):51－ 55.

The Effect of Cold Restraint Stress on the Expression of Heat Shock Protein in Heart and Liver and the Levels of CK，ALT from Serum in Rats

BAO Jing－ying1，LIN Fei－yan1，WANG Yi－long2，HUANG Ka－te3，ZHU Jia－yin1，LIN Ting－ting1，WU Jun1，FANG Zhou－xi4，WU Bu－meng2
(1.School of Life Sciences，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China; 2.Laboratory Animal Science Center，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China; 3.Department of Pathology of the First Affialiated Hospital affiliated to Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China; 4.Electron Microscope Room，Wenzhou Medical College，Wenzhou 325035，China)

ObjectiveTo explore the effect of cold restraint stress on heart and liver of rats，the expression of HSP70 and the levels of CK and ALT in serum was studied。Methods77 SD rats of 50 days old were randomly divided into 7 groups，namely 0 h，0.5 h，1.0 h，1.5 h，2.0 h，2.5 h，3.0 h group.The cold－restrained rats lasted thecorresponding time， then the distributionsofHSP70 in heartand livertissues were examined by means of immunohistochemistry method and the level of CK and ALT in serum was determined。Results(1)The HSP70 expression in heart increased with stress time 1.5 h group had an obvious increase compared with the 0 h group(P ＜ 0.05)，and after 2.0 h group，the increase was more significant.(2)The HSP70 expression in liver increased slowly with stress time. Only 3.0 h group had an obvious increase compared with the 0 h，0.5h and 1.0h group(P ＜0.05).(3)The level of CK rose quickly at the beginning stage of the stress，then changed smoothly.The level of ALT in serum rose with stress time，during the first 2.5 h changed smoothly but significantly increased at 2.5 h group。ConclusionThe cold restraint stress could induce the expression of HSP70 in heart and the level of CK in serum markedly increasing in a short time，and increased with stress time，while the expression of HSP70 in liver and the level of ALT in serum had no markedly change in a short time，only after 3 hours the increase became obvious，it suggests that heart is more sensitive to the cold restraint stress，while liver has more powerful resistance.

Cold restraint stress;Heart;Liver;HSP70;CK;ALT

Q494

A

1671－7856(2010)07－0036－04

2010－01－21

温州市科技计划项目(No:Y20060106)，温州医学院科技发展基金资助项目(No:200801052)。

包晶莹，(1988－)，女，本科，生物科学专业。

吴步猛，高级实验师，从事实验动物科研工作。E－mail:wbm710@wzmc.net