内毒素血症兔白细胞计数、凝血功能动态变化与卫气营血辨证相关性研究*

贺又舜 艾碧琛 赵国荣 肖碧跃 曾序求 何宜荣 张 衎

湖南中医药大学基础医学院（湖南长沙410208）

随着对内毒素血症、全身炎症反应综合征认识的深入，以及近年中医卫气营血辨证对非典型性肺炎、H1N1流感等疾病的确切防治效果，人们越来越意识到卫气营血辨证诊疗感染性疾病的有效性［1］。笔者前期研究结果提示实验兔在大肠杆菌内毒素（LPS）攻毒后，症状和体征出现了较为有规律的3个阶段，即攻毒后0～2h、2～6h、6～36h，3个阶段分别与卫分证、气分证、营血分证相关［2］。本次实验旨在观察内毒素血症兔不同时相白细胞（WBC）总数及分类、血小板计数（BPC）及凝血功能的变化以及3个不同阶段与中医卫气营血辨证的相关性，以期为卫气营血辨证防治内毒素血症的研究提供动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物普通级新西兰大耳白兔，雌雄不限，体质量1.8～2.0kg，由长沙市东创实验动物科技服务部提供，动物许可证号：SCXK（湘）2009-0012。 室温控制在 24～27℃，单笼饲养，自由饮食和摄水。

1.2 试剂LPS Escherichia coli O111：B4购自美国Sigma-Aldrich公司（生产批号118K4052）。

1.3 试剂配备大肠杆菌LPS在无菌条件下以生理盐水配制成10μg/mL溶液，使用前以温水温浴至39℃。

1.4 分组及造模新西兰大耳白兔40只，随机分成空白组8只，1阶段组8只，2阶段组12只，3阶段组12只。1阶段组、2阶段组、3阶段组由耳缘静脉注入大肠杆菌LPS 10μg/kg，空白组注入等量无菌生理盐水。

1.5 观察项目及方法1阶段组观察时相为攻毒后0～2h，2阶段组观察时相为2.1～6h，3阶段组观察时相为6.1～36h。1阶段组在攻毒后1～1.5h内心脏采血5mL；2阶段组在攻毒后4～5h内心脏采血5mL；3阶段组实验兔中，出现精神萎靡，活动度和灵敏度明显下降、结膜充血明显、便血、鼻衄、全身瘫软无力、角弓反张、抽搐等症状、体征者［2］则心脏采血5mL，未出现以上症状者不予采集标本。采集的血液标本分成1、4mL两份，分别进行EDTA-2K、枸橼酸钠抗凝处理，检测血液常规、凝血功能。

1.6 统计学处理应用SPSS 17.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用方差分析，组间两两比较用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 内毒素血症兔各阶段血液常规变化1阶段组、2阶段组WBC计数较空白组明显降低，差异有统计学意义 （P<0.01），3阶段组则比1阶段组、2阶段组升高（P<0.05或0.01）；1阶段组嗜中性粒细胞比空白组降低 （P<0.05）；2阶段组嗜中性粒细胞百分比较空白组升高，2、3阶段组均比1阶段组升高；3个阶段的淋巴细胞均比空白组明显降低（P<0.01），但3个阶段之间的差异不明显；1阶段组淋巴细胞百分比较空白组升高（P<0.05），2、3阶段组则比1阶段组要显著降低 （P<0.01）；1、2阶段组的单核细胞较空白组显著降低 （P<0.01），3阶段组则比1、2阶段组显著升高（P<0.01）。 结果见表1。

2.2 内毒素血症兔各阶段凝血功能变化1阶段组BPC与空白组比较，差异不明显，但2、3阶段组BPC比空白组明显降低（P<0.01）， 而且 3阶段组比 1、2阶段组更为低（P<0.05或0.01）。3阶段组凝血酶原时间（PT）、PT-INR均与空白组有显著性差异 （P<0.05或0.01）；3个阶段的部分活化凝血酶原时间（APTT）均比空白组明显延长（P<0.05），纤维蛋白原（FIB）均较空白组降低（P<0.05或0.01）。3个阶段之间的凝血酶时间（TT）

表1 各组血液常规比较 （±s）

表1 各组血液常规比较 （±s）

与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与1阶段组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与 2阶段组比较，●P＜0.05，●●P＜0.01。 下同。

组 别 n WBC计数（×109/L）嗜中性粒细胞（×109/L） 嗜中粒百分比 淋巴细胞（×109/L） 淋巴细胞百分比 单核细胞（×109/L） 单核细胞百分比空白组 8 5.09±1.66 1.93±1.24 38.09±17.30 2.04±1.71 36.58±24.86 0.45±0.20 10.53±7.20 1 阶段组 8 1.12±1.14** 0.31±0.52*26.34±18.28 0.72±0.85** 59.31±22.17* 0.09±0.08** 10.70±6.82 2 阶段组 12 1.72±1.95** 1.11±1.15 63.73±21.60*▲▲ 0.18±0.15** 24.79±18.55▲▲ 0.05±0.04** 7.22±2.91 3 阶段组 8 4.73±4.40▲▲● 2.59±3.66 49.88±30.64▲ 0.77±0.39** 22.28±19.12▲▲ 0.37±0.21▲▲●● 8.05±6.19

表2 各组凝血功能比较 （±s）

表2 各组凝血功能比较 （±s）

差异不明显。结果见表2。

TT（s）空白组 8 391.65±229.13 9.13±0.19 0.66±0.02 22.11±3.85 4.71±1.01 12.95±1.21 1 阶段组 8 295.15±145.99 9.74±0.51 0.72±0.05 73.98±53.83*2.38±1.52**17.86±12.00 2 阶段组 12 212.04±93.61** 9.97±0.82**0.74±0.08**74.08±45.01*2.77±1.85**13.66±1.72 3 阶段组 8 101.94±38.19**▲▲● 9.70±0.70* 0.73±0.07* 77.06±52.53*2.47±0.98* 13.24±2.57组 别 n BPC（×109/L）（s） PT-INR APPT（s）PT FIB（g/L）

3 讨 论

炎症是机体对各种致炎因子引起损伤所发生的反应，是一种极为常见和重要的基本病理过程。机体发生炎症或其他疾病都可引起WBC总数及各种WBC百分比发生变化，因此检查WBC总数及WBC分类计数成为辅助诊断炎症反应的一种重要方法。本研究结果显示LPS攻毒后，内毒素血症兔的WBC总数随时间呈现动态变化。在LPS作用下WBC沿着血管内皮细胞发生附壁滚动，并游出血管聚集到感染和损伤的部位，以发挥重要的防御作用，从而使得在攻毒后第1阶段血液中WBC总数出现减少。1～2h后，随着LPS与其受体结合后启动炎症细胞内多条信号转导通路，大量激活的炎细胞能产生一系列炎症介质，后者可使炎细胞进一步被激活，并促进骨髓中的WBC释放入血，这正是第2阶段WBC总数开始上升，第3阶段回升至较高水平的主要原因。同时，研究结果还提示此时释放入血的WBC更多的是中性粒细胞。从第2、3阶段WBC水平逐渐回升的趋势可以看出，在第2阶段，炎细胞与促炎介质相互激活，出现了炎症级联反应；第3阶段WBC迅速回升则提示此期促炎介质大量释放、并促进WBC释放入血，炎症反应进一步扩大。

卫气营血辨证是对温病的病理变化及证候类型进行的高度概括，一直以来有效指导着中医外感热病临床诊疗。叶天士以卫气营血的生理功能为基础，将卫气营血的表里层次用来概括病变的深浅及病情的轻重程度，“卫之后方言气，营之后方言血”，温病由卫而气而营而血，是病邪由浅入深，病情由轻转重的变化过程。笔者以往研究已证实用LPS攻毒后，1阶段、2阶段、3阶段的症状体征呈现出由轻转重的趋势［2］，本研究中1阶段→2阶段→3阶段WBC的整体动态变化显示了炎症反应也呈现出发生、发展、升级扩大的由轻到重的趋势，与叶天士所言“卫之后方言气，营之后方言血”反映的病情变化规律相符合。

病原微生物侵入机体后，一方面激活炎细胞及炎症介质，另一方面也会激活凝血与纤溶系统。本研究显示攻毒后第1阶段开始，PT以及PT-INR、APTT即出现上升趋势，同时FIB亦从第1阶段即开始下降，呈现出弥漫性血管内凝血（DIC）的实验室改变特征，反应此期已出现凝血、抗凝及纤维蛋白溶解系统的紊乱，并且一开始即表现出低凝、纤溶，这提示静脉注射LPS后引起DIC急性进展。在第1阶段即出现低凝、纤溶等，与不少学者认为凝血功能异常是温病过程中一个重要的病理变化是一致的［3］。但此期的BPC减少并不显著，故低凝状态尚不严重，出血倾向并不会明显，故一般并不会出现出血症状，符合温病卫分证的病机。进入第2、3阶段，PT及APTT仍然处于延长的状态，FIB亦保持下降，最突出而重要的变化是BPC呈进行性下降，第3阶段下降至整个实验过程的最低值，提示第2、3阶段大量BPC持续被消耗，逐渐引起凝血障碍；同时随着纤维蛋白大量降解，纤维蛋白降解产物有多方面的抗凝作用，最终导致低凝状态的加重，从而可引起出血症状。实验观察到的第3阶段部分实验兔出现便血、鼻衄［2］正是因此而发生。上述凝血功能的变化提示本实验内毒素血症兔第3阶段的病理与温病营分证营热阴伤、扰神窜络的病机及血分证迫血妄行、瘀热内阻的病机密切相关。从1阶段→2阶段→3阶段凝血功能变化整体来看，体现的也正是由卫而气再至营血分，病情由轻到重的整体变化规律。

［1］赵国荣，肖碧跃，卢岳华，等.卫分证与气分证、营分证IL-6、IL-10变化规律对比研究［J］.新中医，2005，37（6）：19-21.

［2］艾碧琛，赵国荣，贺又舜，等.卫气营血阶段性与内毒素血症兔不同时相症状、体征的相关性研究［J］.湖南中医药大学学报，2011，31（3）：10-13.

［3］林培政，葛文华.温病实验研究概况［J］.新中医，2003，35（5）：74-76.