康脑液2号对脑缺血再灌注损伤大鼠血清及脑组织中NO、NOS含量的影响*

石会娟 梁起保 薛 茜 邹玉安△

1河北北方学院（河北张家口075000）

2河北省新乐市医院（河北新乐050700）

3河北北方学院附属第一医院（河北张家口075000）

缺血性脑中风主要以药物治疗为主，中药复方以其多水平、多通道、多靶点治疗原则备受青睐。康脑液2号主要由黄芪、当归、川芎、葛根、钩藤、地龙、天麻、三七等中药组成，以益气活血化瘀、清热平肝、息风定惊为主要功能。本实验通过建立大鼠脑缺血再灌注模型，观察康脑液2号对大鼠血清及脑组织中一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）含量的影响，并探讨其可能的作用机制，为缺血性脑血管病的临床治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 动物成年健康雄性SD大鼠40只，SPF级，体质量（280±10）g，由北京大学医学部实验动物中心提供，许可证号：SCXK（京）2001-2008。

1.2 药物康脑液2号主要由黄芪、丹参、川芎、葛根、钩藤、地龙、天麻、三七等组方。制备：冷水浸泡20min后，常规煎煮3次，再将3次所煎的药汁上清液混合，文火煎浓缩至70mL。依达拉奉注射液（南京先声东元制药有限公司提供，国药准字H20050280）。

1.3 试剂和仪器NO、NOS试剂盒 （南京建成生物工程研究所，批号：20100625）；其他试剂均为国产分析纯。栓线（北京沙东生物技术有限公司产品）；光学显微镜（日本Olympus BX60型）LabTech-紫外分光光度计（北京莱博泰科仪器有限公司）等。

1.4 分组及造模随机分为假手术组、模型组、康脑液2号组（14.30g/kg·d），依达拉奉组（10.00mg/kg·d），每组 10 只。 术前 7d灌胃给药，每日1次，每次给药2mL（相当于原生药4g），假手术组、模型组灌胃等容量生理盐水。末次灌胃后1h参照改进Longa［1］线栓法制备大鼠MCAO模型。模型组及治疗组插入栓线约18～20cm，缺血2h后将栓线拉回颈总动脉进行再灌注24h。假手术组不插入线栓，其余步骤同上。

1.5 神经系统症状评分标准0分，未观察到神经功能缺陷症状；1分，不能完全伸展手术对侧前爪；2分，向手术对侧转圈；3分，向手术对侧倾倒；4分，不能自发行走，意识昏迷。

1.6 标本采集与检测脑梗死体积测定：断头后立即冰浴取脑，分离并去除嗅球、小脑和低位脑干，置于-20℃冰箱冷冻20min，取出连续冠状切片，置于2%氯化2，3，5-三苯基四氮唑（TTC）磷酸盐缓冲液中，37℃避光恒温孵育 30min，7～8min翻动1次，正常脑组织染成红色，梗死区为苍白色，置于4%多聚甲醛溶液固定24h，拍照，分离红色和白色区域，称质量并计算梗死体积。HE染色观察组织学变化：10%水合氯醛麻醉大鼠，开胸左心室插管，灌注肝素盐水50mL（100U/mL），迅速剪开右心耳继续灌注4%多聚甲醛300mL，30min开颅取脑，去除小脑和脑干，从视交叉平面行4mm厚冠状切片，将脑片放入4%多聚甲醛固定液中固定，脑片经常规梯度脱水、透明、包埋、切片，苏木精伊红染色，光镜下观察组织学变化。血清及脑组织NO、NOS含量测定：缺血2h再灌注24h后断头取血，分离血清，冰浴取脑，右侧脑组织用4℃生理盐水制成10%脑组织匀浆，3500r/min离心15min，取上清置于-80℃冰箱备用。按照试剂盒说明书测定血清以及脑组织中NO含量及NOS活力。

1.7 统计学处理采用SPSS 10.0统计软件。组间比较采用单因素方差分析，各项指标以（±s）表示。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组神经功能评分比较与假手术组比较，模型组大鼠出现明显的神经功能缺损症状 （P<0.05），脑缺血2h再灌注24h后神经功能缺损症状最明显；与模型组比较，康脑液2号组及依达拉奉组神经功能缺损症状明显减轻，差异具有统计学意义（P<0.05）。 结果见表 1。

表1 各组神经功能评分及脑梗死体积比较 （±s）

表1 各组神经功能评分及脑梗死体积比较 （±s）

与假手术组比较,*P＜0.05;与模型组比较,△P＜0.05;与依达拉奉组比较,▲P＜0.05。下同。

脑梗死体积（mm3）假手术组 10 0组 别 n 神经功能评分（分）模型组 10 2.49±0.16* 235.63±20.16*康脑液 2号组 10 1.21±0.12*△▲ 128.68±28.18*△▲依达拉奉组 10 1.62±0.14*△ 127.32±10.14*△

2.2 各组脑梗死体积比较与假手术组比较，模型组可见明显脑梗死灶，差异具有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，康脑液2号组及依达拉奉组脑梗死体积显著降低（P<0.05）。结果见表1。

2.3 各组脑组织形态学变化光镜下观察，假手术组大脑皮质及海马神经细胞形态基本正常，核仁清晰，核膜完整。模型组缺血侧大脑皮层和海马神经细胞变性坏死明显，胞体肿胀，周围间隙增宽，结构不清，出现不同程度的变形、核深染、核固缩、核溶解、细胞坏死、间质疏松等现象，神经元细胞肿胀和间质水肿较为明显。与模型组比较，康脑液康脑液2号组及依达拉奉组可明显改善上述病理变化。

2.4 各组血清及脑组织NO含量及NOS活力比较与假手术组比较，模型组血清及脑组织中NO含量及NOS活性显著升高（P<0.01）；与模型组比较，康脑液康脑液2号组及依达拉奉组NO含量及NOS活性显著降低（P<0.05）。见表2、表3。

表2 各组大鼠脑组织NOS活力、NO含量比较 （±s）

表2 各组大鼠脑组织NOS活力、NO含量比较 （±s）

NO（μmol/mg）假手术组 6 2.83±0.46 85.86±13.46组 别 n NOS（U/mg）模型组 6 7.94±1.02* 192.65±10.52*康脑液2号组 6 3.49±0.38*△▲ 117.26±16.57*△▲依达拉奉组 6 3.97±0.66*△ 127.26±12.85*△

表3 各组大鼠血清NOS活力、NO含量比较 （±s）

表3 各组大鼠血清NOS活力、NO含量比较 （±s）

组 别 n假手术组 6 NOS（U/mL）18.69±3.93模型组 6康脑液2号组 6 29.63±3.64*23.25±4.75*△▲依达拉奉组 625.27±4.86*△NO（μmol/mL）39.75±8.02 79.97±4.56*43.73±7.53*△▲49.73±10.38*△

3 讨 论

NO是一种新的自由基、神经递质，对缺血性脑血管疾病的发生和发展有着十分重要的作用。正常状态下生物体内NO具有内皮源舒张因子的特性，可舒张脑血管、调节脑血流，并可作为神经介质参与长程增强效应、突触的可塑性和记忆的形成等［2］。脑缺血再灌注损伤后，NO在中枢神经系统所发挥的作用主要取决于NO在生物体内的浓度、产生部位和时间、作用部位的不同及其氧化还原状态等复杂的生物学性质。氧化状态的NO，能调节离子通道，减少胞质游离Ca2+水平而发挥脑保护作用，而还原型的NO可迅速与超氧阴离子反应生成毒性更强的过氧亚硝酸阴离子（ONOO-），导致膜功能失调；过量的NO又可通过多种信号转导途径引起神经损害，加重脑缺血损伤。NOS是合成NO的限速酶。脑缺血发生后血管内皮细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）免疫阳性表达立即增加，源于eNOS的NO对脑缺血具有神经保护作用，能通过激活鸟苷酸环化酶使血管平滑肌舒张，抑制血小板聚集和白细胞黏附，增加半暗带区脑血流量，抑制内皮素的生成［3-4］。随着缺血时间的延长，脑缺血后期，Ca2+超载可上调源于nNOS和iNOS的NO在神经组织中的表达［5-6］，对缺血后的脑组织具有神经毒性作用，可介导兴奋性氨基酸（EAA）的毒性，促进自由基生成，损伤线粒体，诱导细胞凋亡。

缺血性脑血管病属中医学“中风”范畴，本病因患者素体气血亏虚，与心、肝、肾阴阳失调，加以忧思恼怒，或劳累、外邪等诱因下，致气血运行受阻，肌肤筋脉失于濡养，致阴亏于下，肝阳暴涨，阳化风动，血随气逆，夹痰夹火，横窜经络，蒙蔽清窍而猝然昏仆，半身不遂等症。康脑液2号是专门为气虚血瘀患者而设的临床经验方，从益气活血的鼻祖方补阳还五汤按照现代人特点化裁而来，由黄芪、当归、川芎、葛根、地龙、三七、丹参、天麻、钩藤等组成，君以大量黄芪补气升阳，益卫固表。当归善于活血养血，有化瘀而不伤血之妙，是为臣药。川芎、葛根、地龙、三七、丹参等助当归活血化瘀，为佐药。钩藤、天麻引药上行，是为使药，君臣佐使共奏补气活血化瘀之功。并且近年来各味中药的单药研究［7-10］表明，均有不同程度的抗自由基、扩张血管、改善微循环、抗血小板聚集、抑制微小血栓形成、减少细胞内钙蓄积等作用。

在临床上，益气活血法是治疗缺血性脑卒中的常用方法，本研究采用康脑液2号组方对脑缺血再灌注损伤大鼠进行干预，模型组血清及脑组织匀浆中NO含量及NOS活性明显高于假手术组，而药物治疗组血清及脑组织匀浆中NO含量及NOS活性有所降低，说明脑缺血再灌注损伤时NO可加重脑组织损伤程度，而康脑液能降低脑组织中NO的含量及NOS活性以减轻神经细胞损伤。NO在缺血性脑损伤的病理过程中发挥了重要作用，并且与NOS表达的变化密切相关，康脑液2号可能通过调节脑缺血再灌注损伤后血清及脑组织中NO、NOS表达而减轻神经细胞损伤，使脑血管病的防治更进步，为缺血性脑血管病的预防及治疗提供了新的前景。

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