复方马钱子凝胶剂对大鼠痛阈值及血清IL-6表达水平的影响

谭震宇

浙江省桐庐县中医院（浙江桐庐311500）

外治法是中医治疗方法的一个重要组成部分，主要是通过肌肤、孔窍施治，可以达到通经贯络的功能，深入腠理、脏腑，有效调整阴阳气血［1］。复方马钱子凝胶具有活血通络、祛风散寒、消肿止痛之功。本研究为进一步评价其抗炎镇痛作用及其镇痛抗炎的机理，通过观察复方马钱子凝胶对模型动物痛阈值影响的实验研究，旨在发现运用中医外治法治疗伤科疼痛病证的有效方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂Labsystems Dragon Wellscan MK-3全自动多功能酶标仪；YLS-3E电子压痛仪，由山东省医学科学院设备站研制。酶标测定仪由潍坊医科大学临床检验中心提供。PB602-E型分析电子天平，瑞士梅特勒-托利生产。Carbomer940为北京鑫洲科技有限公司产品，Azone为福建寿宁美菲思生物化学品厂，血清IL-6 ELISA试剂盒为美国R&D公司产品。40%甲醛为重庆川东化工集团公司产品；5%甲醛溶液以稀释40%甲醛而成；双氯芬酸二乙胺乳胶剂（扶他林），由北京诺华制药有限公司生产。

1.2 实验动物SD大鼠由潍坊医科大学动物实验中心提供，体质量180～200g，自由饮水及进食，大学实验动物中心提供的标准饲料饲养，动物室通风良好。

1.3 实验药物在80℃的条件下，取复方马钱子生药材（制马钱子、当归、细辛、祖师麻、白芍、川芎、防风、桂枝等）水煎浓缩，含生药量2.4g/g浸膏，将原药材去渣浓缩成棕黑色药膏。取卡波姆加入适量的双蒸水待溶解肿胀完全后，加甘油研匀，再加丙二醇和月桂氮酮和无水乙醇，研匀使完全溶解肿胀，搅拌均匀，另取三乙醇胺滴定，中和酸碱到pH6～6.5适量，得到空白凝胶，避光密封保存［2］。氮酮在低浓度（2.5%）时就能极大增强药物的透皮作用［3］。使用空白凝胶基质加复方马钱子药膏，分别配制成含生药0.5、0.25、0.125g/g 3个剂量的复方马钱子凝胶，避光密封保存备用。

1.4 造模方法本研究采用注射大鼠右后足跖底部复制疼痛模型，甲醛诱导大鼠炎症痛模致炎模型［4］。大鼠甲醛致炎性疼痛模型选用阳性对照药物扶他林乳胶剂。

1.5 大鼠痛阈值的观察致炎前首先采用压痛仪测定各组大鼠右后足跖的原始痛阈。然后将50只雄性SD大鼠随机分为空白对照组（给予外敷基质凝胶10g/kg），阳性对照组（外敷扶他林乳剂10g/kg）、复方马钱子凝胶高、中、低剂量组（分别按相应剂量外敷复方马钱子凝胶10g/kg）。每日3次，第4日每只大鼠右后足跖皮下注射5%甲醛溶液0.1mL致炎，致炎后立即在右后足局部涂抹药物，测定致炎后 6、24、48、72h 的痛阈值并记录结果［5-6］。 实验结束后，处死大鼠，取大鼠血液离心血清-20℃冰箱保存备用。

1.6 大鼠血清中白细胞介素-6（IL-6）测定采用双抗体两步夹心酶联免疫吸附法（ELISA），按照说明书建立标准曲线。待测孔中加入血清样本10μL，再加样本稀释液40μL，反应板置37℃孵育 30min； 洗板 4～6次， 加入酶标工作液 50μL，37℃孵育30min；洗板 4次，先后加入A、B显色剂各 50μL，37℃避光孵育15min；每孔加终止液50μL，450nm波长处测吸光值（OD值）。最小检测质量浓度5ng/L，最大质量浓度为160ng/L。记录每孔OD值结果，并绘制标准品的剂量反应曲线，其回归方程为Y=85.501-57.739X，r2=0.9853。查找血清样本中IL-6的质量浓度，记录样本质量浓度。

1.7 统计学处理数据以（±s）表示，应用 SPSS18.0统计软件。对各组结果进行方差分析（ANOVA）以基质组为共用对照组进行Dunnett-t检验，比较各组的差异性，配合直线回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 复方马钱子凝胶给药后对甲醛致大鼠甲醛致足跖压痛差值的影响见表1。分别在6、24、48、72h各时间点对5个组进行方差分析， 结果为 6h F=12.92；24h F=3.447；48h F=25.083；72h F=20.887；各时间点比较差异具有统计学意义（P<0.05）。

2.2 复方马钱子凝胶对甲醛致足跖疼痛大鼠IL-6的影响随给药剂量增大对IL-6表达的抑制越明显，各给药组大鼠血清中IL-6水平，均显著低于空白对照组（P<0.05），马钱子凝胶高剂量组IL-6降低最为显著（P<0.05）。见表2。

3 讨 论

中医药界自古就重视中药体外用药的途径，先后创制出一系列外用药物剂型［3］。中医素有“内病外治”的理念，复方马钱子凝胶针对中医疼痛产生的机理，在临床上有一定的疗效［4，7］。方中马钱子性温，有大毒，有通络散结，消肿定痛的功效，为君药；祖师麻辛温有小毒，能祛风散寒除湿、活血散瘀止痛，细辛辛温有毒，祛风散寒止痛力强，共为臣药；当归、白芍养血活血，川芎祛风行气止痛，防风祛风散寒，桂枝散寒通络止痛，同为为佐使；全方共奏祛风散寒、行气活血、通络止痛之功，可达到治疗痛证之目的［8］。

表1 各组给药后大鼠甲醛致足跖压痛差值比较 （±s）

表1 各组给药后大鼠甲醛致足跖压痛差值比较 （±s）

组 别 n 6h空白对照组 10-21.53±9.38阳性对照组 10 13.44±7.43 24h-22.52±6.95 22.50±13.55 48h-22.58±9.26 28.48±16.48 72h-15.51±5.80 26.39±15.27复方马钱子凝胶低剂量组 10 22.45±10.02 24.65±7.12 19.73±7.69 15.45±12.99复方马钱子凝胶中剂量组 10 23.10±12.47 18.34±9.40 20.78±7.38 22.21±10.21复方马钱子凝胶高剂量组 10 24.64±16.44 43.00±16.3036.98±21.5329.34±19.32

表2 各组大鼠血清 IL-6水平比较 （ng／L，±s）

表2 各组大鼠血清 IL-6水平比较 （ng／L，±s）

与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组 别 n IL-6空白对照组 10 93.05±24.69阳性对照组 10 54.09±28.19*复方马钱子凝胶低剂量组 10 46.32±25.03*复方马钱子凝胶中剂量组 10 41.47±15.26*复方马钱子凝胶高剂量组 10 33.32±25.29**

文献报道［5］，在急性炎症时IL-6及急性期反应物产生会增加甲醛引起的继发性炎性疼痛，它刺激C纤维末梢和周围细胞释放各种炎性介质如组胺、前列腺素和缓激肽等，进一步使感受伤害性刺激的初级传入纤维兴奋。凝胶剂是一种新型外用剂型，适用于皮肤、黏膜及腔道，能容纳的药物类型较广，凝胶剂中一般均可选择性添加透皮吸收促进剂，促使药物吸收加快和完全，较快地发挥疗效。其中炎症调节细胞因子IL-6是一组由淋巴细胞、单核-巨噬细胞和血管内皮细胞等产生的免疫活性因子，参与机体的免疫反应、应激反应和炎症调节等重要作用。实验发现在甲醛炎痛模型大鼠血清中，检测到了空白对照组IL-6水平显著升高，复方马钱子凝胶治疗组IL-6水平显著下降，同时伴有痛阈升高，提示复方马钱子凝胶的抗炎镇痛作用可能与下调IL-6的表达及升高痛阈值有关。可能与抑制大鼠体内相关免疫细胞及其他多种相关细胞产生IL-6，减轻炎症介质的释放。与朱建伟等［6］证实马钱子具有较强的镇痛作用一致。复方马钱子凝胶除了有明显镇痛作用的祖师麻、马钱子、细辛外，还含有白芍、当归、川芎等养血活血等药物，能改善炎症局部组织微循环，有效地抑制软组织损伤的炎性反应，加强大鼠镇痛作用方面具有显著的协同效应。

综上所述，本文观察复方马钱子制剂的抗炎、镇痛作用及其对疼痛相关细胞因子的影响，同时提示了抑制IL-6活性可能成为治疗炎症相关性疼痛的有效途径，进一步证明了复方马钱子凝胶在急性炎症疼痛方面的优势，但其机理有待系统、深入、细致的研究。

［1］方和桂.适用于中药外用的剂型凝胶剂［J］.中国药业，2002，11（8）：58-26.

［2］李明华，张艳.马钱子碱对大鼠海马神经元钠道的影响［J］.新乡医学院学报，2003，20（6）：389-392.

［3］李燕，刘新.RP-HPLC法测定雷公藤甲素外用凝胶中雷公藤甲素的含量［J］.重庆医科大学学报，2008，33（7）：862-863.

［4］赖芸.促进药物透皮吸收方法的研究进展［J］.赣南医学院学报，2008，28（6）：957-958.

［5］陈荣明，姜淼，殷书梅，等.复方南星止痛膏对甲醛等致炎性疼痛模型大鼠止痛作用及c-fos表达的影响［J］.世界中西医结合杂志，2008，3（8）：455-456.

［6］朱建伟，武继彪，李成韶，等.马钱子碱镇痛作用及其药效动力学研究［J］.中国中医药科技，2005，12（3）：166-167.

［7］Abbott F V，Franklin K B，Westbrook R F.The formalin test：scoring properties of the first and second phases of the pain response in rats［J］.Pain，1995，60（1）：91-102.

［8］谭煌英，李园，于莉莉，等.康莱特对大鼠的镇痛作用及其对促炎细胞因子的影响［J］.中国中西医结合外科杂志，2O07，13（2）：349-350.