胰淀素对肥胖相关性肾病大鼠的致病作用

滕春燕 卢延军 崔英春 刘树军 张冬梅

(吉林大学第二医院化验科，吉林 长春 130041)

现在认为肥胖相关性肾病(Obesity-related glomerulopathy，ORG)的发生是体内存在胰岛素抵抗(Insulin resistance，IR)的直接后果。已经证明，由糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)患者体内IR所致的高胰岛素血症和高胰淀素(Amylin)血症，可以导致Amylin在肾小球和肾间质的沉积，而成为肾小球结节样病变以及间质性损伤的病因之一。此外，Amylin还可以诱导系膜细胞凋亡，通过诱导细胞凋亡加重局部组织损伤和纤维化的形成。ORG也伴有IR，也会出现高胰岛素血症和高Amylin血症，但是否可以导致Amylin在肾小球的沉积、诱发肾脏损伤，目前尚未见相关报道。本实验拟通过观察ORG血液及肾脏病理学变化特征，探讨Amylin在ORG中的致病作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 注射用大鼠 Amylin(Sigma公司);大鼠Amylin-ELISA检测试剂盒(上海恒远生物科技有限公司);兔抗大鼠Amylin单克隆抗体、生物素化羊抗兔IgG及免疫组化试剂盒(Sigma公司)。

1.1.2 实验动物 清洁级成年雄性Wistar大鼠40只，体重(200±20)g，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制作及分组 大鼠适应性喂养3 d，随机分为三组:正常对照组(NC组，n=10)、ORG组(n=10)和Amylin皮下注射组(Amylin组，n=10)。根据文献建立ORG大鼠模型〔1〕，ORG组和Amylin组大鼠给予高脂饲料(三大营养素所占比例:脂肪49%，蛋白质21%，碳水化合物30%;具体组成:普通饲料59%，熟猪油20%，鸡蛋黄10%，蔗糖9.5%和食盐1.5%，热卡21 kJ/g)，NC组给予普通饲料，自由摄食，自由饮水。ORG组和Amylin组大鼠在饲养8 w后用尿蛋白试纸检测尿蛋白，出现尿蛋白即为ORG模型成功。ORG模型成功后，Amylin组大鼠给予大鼠Amylin皮下注射(100 μg/kg)〔2〕，隔日1次，持续8 w。NC组和ORG组大鼠给予同等剂量的生理盐水皮下注射。

1.2.2 标本采集 实验共经历24 w，大鼠处死前代谢笼留取24 h尿，检测24 h尿蛋白定量(24 h-PRO)。乙醚麻醉下称体重，测量体长即鼻至肛门的长度。心脏取血，3 000 r/min离心10 min，分离血清，－70℃保存。迅速开腹取出左肾，去掉被膜，经肾门冠状面取肾组织，置于新配制的10%中性缓冲甲醛液固定，用于光镜观察及免疫组化检测。

1.2.3 各项指标的检测 (1)Lee's指数的计算:Lee's指数=〔体重(g)〕1/3×103/体长(cm)。(2)24 h-PRO检测:考斯亮蓝方法检测。(3)血清学指标检测:采用ELISA法检测血清Amylin水平;放射免疫法检测胰岛素水平;自动生化分析仪测定血糖(SG)、血脂。(4)胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)计算公式:空腹血糖×空腹胰岛素水平/22.5。(5)免疫组化亲合素-生物素复合物(ABC)法:肾组织切片3μm，常规脱蜡至水，加入兔抗大鼠Amylin单克隆抗体(1∶100稀释)，再加入生物素化的羊抗兔IgG(1∶100稀释)，二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木素复染细胞核，封片观察。

1.3 统计学分析 应用SPSS14.0统计软件，数据以x±s表示，采用方差分析。两组以上比较采用one way ANOVA检验。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态 4 w内NC组大鼠进食和饮水情况、精神状态以及活动状况均正常;ORG组和Amylin组大鼠进食量减少，饮水明显增加，行动迟缓，活动量减少。6 w后ORG组和Amylin组大鼠进食量逐渐增加，饮水仍然较多，毛发色泽鲜亮，精神状态良好，活动增加;实验结束时，ORG和Amylin组大鼠饮水和尿量均明显增多，毛发光亮度减退，活动减少，精神出现不同程度的萎靡。

2.2 各组大鼠Lee's指数 分组时(0 w)各组大鼠Lee's指数比较无统计学差异，饲养至24 w实验结束时，ORG组和Amylin组Lee's指数显著高于NC组(P＜0.01)，ORG组和Amylin组两组间无显著差异(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠Lee's指数值(x±s)

2.3 各组大鼠 SG、血脂、HOMA-IR、Amylin水平及24 h-PRO的变化 与NC组比较，ORG组和Amylin组大鼠的SG、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、HOMA-IR和24 h-PRO均增高，其中ORG组的TC和24 h-PRO差异具有显著性(P＜0.05)，Amylin组除血糖外，其余各指标差异均具有显著性(P＜0.01)，但两组血糖虽升高，均在正常范围内且差异无显著性。与ORG组比较，Amylin组除SG和HOMA-IR外，其余各指标差异均具有显著性(P＜0.01)。见表2。

2.4 各组大鼠肾小球形态学变化 见图1。光镜下，ORG组和Amylin组可见肾小球体积增大，Amylin组包曼氏囊腔增宽，两组肾小球可见节段性系膜细胞增生和系膜基质增多，部分肾小球球旁器肥大，较NC组变化明显。

表2 各组大鼠SG、血脂、HOMA-IR、Amylin水平及24小时尿蛋白定量的变化(x±s)

图1 各组大鼠肾小球形态学变化(PAS染色，×400)

2.5 各组大鼠肾小球免疫组化结果 NC组大鼠无Amylin表达，ORG组和Amylin组大鼠肾小球增宽的系膜区有表达，Amylin组表达量较多。见图2。

图2 Amylin在各组大鼠肾脏中的表达(ABC法，×400)

3 讨论

肥胖在全世界呈流行趋势，使其已经与艾滋病、吸毒和酗酒并列为世界四大生活难题，被公认为困扰人类健康的重要顽症之一。已有研究证实肥胖可以引起肾损害，并命名为ORG。2002年6月我国首次报告ORG后〔3〕越来越多的研究者开始关注ORG，目前ORG尚无统一诊断标准〔4〕。研究表明IR、脂质代谢紊乱(高脂血症)、肾脏血流动力学改变(肾脏高滤过、高灌注)、肾素血管紧张素系统(RAS)活化及交感神经系统(SNS)激活等是ORG的主要发病机制，其中IR在ORG的发病过程中起了重要的作用。IR状态可影响多个脏器，包括骨骼肌、肝脏、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞。胰岛素能扩张入球小动脉引起肾小球高内压、高灌注及高滤过;通过刺激胰岛素样生长因子(IGF)合成，引起肾小球肥大;通过上调转化生长因子(TGF-β)的表达促进肾小球硬化。高胰岛素亦可以直接作用于肾脏促进钠潴留。胰岛素还能直接通过增加肾小管对尿酸的重吸收，导致高尿酸血症，加重肾脏损伤〔5〕。

本研究发现，ORG组大鼠Lee's指数在第8周开始显著增加，直至24 w实验结束，生化指标中TC和24 h-PRO明显增加，余生化指标仅轻度增加，差异无显著性，免疫组化观察少许Amylin在增宽的系膜区表达;而Amylin组大鼠除血糖外其余各项指标均显著增加，免疫组化可见大量Amylin在增宽的系膜区表达。由此推测，Amylin是病情发生过程中产生的一种蛋白因子，其本身可促进病情加重，随着病情加重进一步产生Amylin，即Amylin与ORG互为因果，相互促进。Amylin是一种纤维样多肽，与胰岛素共同储存在胰岛细胞的分泌颗粒中，当Amylin表达、分泌异常时，可形成胰岛淀粉样蛋白，沉积在胰岛细胞内及其周围，对胰岛β细胞有细胞毒性作用，使胰岛β细胞团及胰岛素分泌减少，导致β细胞功能障碍和部分胰岛β细胞的丧失〔6，7〕，进而参与IR及糖尿病相关组织器官损伤。本文预实验时统计结果发现，Amylin组大鼠SG呈上升趋势，已有2只大鼠SG接近糖尿病大鼠模型的血糖标准(16.7 mmol/L)，其可能是肥胖易发生糖尿病的致病因素之一。同时，免疫组化结果观察到Amylin在模型大鼠肾脏增宽的系膜区沉积，与龚伟等研究结果一致〔8〕。

综上所述，Amylin在ORG发生发展的过程中发挥重要作用，其机制有待于进一步研究，并可能成为DN和ORG新的治疗靶点。

1 Kambham N，Markowitz GS，Valeri AM，et al.Obesity-related glomerulopathy:an emerging epidemic〔J〕.Kidney Int，2001;59(14):1498-509.

2 张 强，武明虎，张晓东.肥胖相关性肾病大鼠模型的建立及评价〔J〕.山西医科大学学报，2008;39(4):317-320.

3 Roth JD，Trevaskis JL，Wilson J，et al.Antiobesity effects of the beta-cell hormone amylin in combination with phentermine or sibutramine in dietinduced obese rats〔J〕.Int J Obes，2008;32(8):1201-10.

4 陈惠萍，朱茂艳，张 波.肥胖相关性肾病〔J〕.肾脏病与透析肾移植杂志，2002;11(3):291-4.

5 张建江，易著文，杨华彬.肥胖相关性肾病的诊断〔J〕.实用儿科临床杂志，2006;21(5):316-7.

6 谭会斌，傅淑霞.肥胖相关性肾病发病机制的研究进展〔J〕.河北医科大学学报，2009;30(1):92-4.

7 Ehrlich JC，Ratner IM.Amyloidosis of the islets of Langerhans，Arestudy of islet hyalin in diabetic and non-diabetic individuals〔J〕.Am J Pathol，1961;38(1):49-59.

8 龚 伟，刘志红，彭 艾，等.糖尿病肾病组织胰淀素沉积及其致病意义〔J〕.肾脏病与透析肾移植杂志，2006;15(3):210-8.