松龄血脉康对THP-1源性泡沫细胞ABCA1蛋白表达及细胞内胆固醇含量的影响

苟连平 吕 湛 王玉兵 李卫东 胡龙江

(川北医学院附属医院心内科，四川 南充 637000)

动脉粥样硬化(AS)是心脑血管疾病共同的病理学基础，尽管AS的发病机制多种，但公认`有泡沫细胞的形成。当单核/巨噬细胞被激活后，摄取氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)，吞噬大量脂质而形成泡沫细胞，泡沫细胞的生成和浸润是AS形成的关键。腺苷三磷酸结合盒转运体1(ABCA1)蛋白为跨膜糖蛋白，其相对分子质量为220×103，含有2 261个氨基酸，参与生物膜间物质的转运。罗格列酮可以促进泡沫细胞ABCA1蛋白的表达，降低细胞内胆固醇含量，减轻细胞泡沫化，从而防治AS和冠心病(CHD)。本课题以罗格列酮为参照，观察松龄血脉康对THP-1源性泡沫细胞ABCA1蛋白表达及细胞内胆固醇含量的影响，探求中药松龄血脉康抗AS的可能机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 RPMI-1640培养基，美国Gibco公司。新生小牛血清，成都哈里生物工程有限公司。THP-1单核细胞株，四川大学免疫教研室。佛波脂(PAM)、罗格列酮为美国Sigma公司。鼠抗人单克隆ABCA1一抗，英国Abcam公司。FITC标记的山羊抗鼠IgG二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司进口分装(原产于美国)。松龄血脉康由成都康弘药业集团股份有限公司惠赠。油红O，美国Amresco公司。BCA试剂盒，美国Pierce公司。超速离心机，美国Beckman Culture Optima L-100 XP型。胆固醇检测试剂盒，国产。

1.2 方法

1.2.1 LDL的分离提取、氧化修饰及泡沫细胞模型建立、鉴定健康人血浆来自本院体检健康者。①LDL的分离〔1〕:正常人新鲜血浆经密度梯度超速离心，分离LDL。②LDL的氧化修饰:将上述透析好的LDL置于15μmol/L CuSO4溶液中透析氧化24 h，0.45μm的微孔滤器过滤，并用BCA法测定其浓度。③泡沫细胞模型建立、鉴定:含10%新生小牛血清的RPMI-1640培养基THP-1细胞。2～3代的THP-1细胞于含PAM 160 nmol/L，0.3%BSA的无血清培养基中培养72 h，细胞分化为巨噬细胞。分化好的巨噬细胞，换液(含0.3%BSA的无血清RPMI1640培养基)，同时加入 50 mg/L ox-LDL，在 37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，用油红O染色证实细胞中形成大量脂质小滴，提示已转变为泡沫细胞。

1.2.2 药品的配制 用DMSO分别将松龄血脉康、罗格列酮充分溶解，配制成实验浓度(通过MTT比色法确定)100倍的储备液，－70℃保存，临用前用培养液100倍稀释，0.22μm的一次性滤器过滤除菌，4℃保存。

1.2.3 实验分组及实验方法 浓度为3×106/L的泡沫细胞于培养瓶，分为3组。对照组(泡沫细胞液中无药物干预)、罗格列酮组、松龄血脉康组;每组设4个复瓶。同一浓度下罗格列酮(终浓度10μmol/L)、松龄血脉康组(终浓度0.81 mg/L，据预实验)，在 37℃、5%CO2培养箱中孵育 6、12、24 h。同一时间(24 h)下，与不同浓度(1、10、20 μmol/L)的罗格列酮、不同浓度(0.40、0.81、1.6 mg/L)的松龄血脉康孵育。

1.2.4 ABCA1蛋白及细胞内胆固醇检测 流式细胞术检测ABCA1蛋白表达。氯仿-甲醇法提取培养液中的胆固醇。

1.3 统计学分析 应用SPSS10.0统计软件进行分析，计量资料用x±s表示。组内计量资料的比较用单因素方差分析，组内两两比较用q检验。两组间计量资料的比较用t检验。

2 结果

2.1 不同时间点罗格列酮对ABCA1蛋白表达及胆固醇的影响 泡沫细胞与0.81 mg/L的松龄血脉康、10μmol/L的罗格列酮作用6、12、24 h后，松龄血脉康组、罗格列酮组其ABCA1蛋白表达量均较对照组明显增多，而细胞内胆固醇含量减少(P＜0.05)。见表1。

表1 不同时间对THP-1源性泡沫细胞ABCA1蛋白的表达及细胞内胆固醇含量的影响(x ± s，n=4)

表2 不同浓度松龄血脉康、罗格列酮对THP-1源性泡沫细胞ABCA1蛋白的表达及细胞内胆固醇含量的影响(x ± s，n=4)

2.2 不同浓度松龄血脉康与罗格列酮对ABCA1蛋白及胞内胆固醇含量的影响 泡沫细胞与0.40、0.81、1.6 mg/L的松龄血脉康，1、10、20μmol/L的罗格列酮作用24 h后，松龄血脉康组、罗格列酮组其ABCA1蛋白表达量均较对照组明显增多，而细胞内胆固醇含量减少(P＜0.05)。见表2。

3 讨论

ABCA1蛋白是一种整合膜蛋白，利用ATP作为能量，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，在胆固醇逆向转运中和高密度脂蛋白生成的起始步骤中起着重要作用，被称做胆固醇逆向转运的守门人。ABCA1蛋白功能障碍将导致巨噬细胞内胆固醇的沉积而成为泡沫细胞〔2，3〕，继而浸润血管壁，促进AS的发生发展。相反，增加ABCA1蛋白的表达，则有利于促进细胞内胆固醇的流出〔4，5〕，从而防治 AS和 CHD。松龄血脉康胶囊由葛根、鲜松叶、珍珠层粉组成，3味中药配伍具有平肝潜阳、荣养阴血、镇心安神的功效，有抗AS和CHD作用〔6〕，其机制是否也与ABCA1蛋白的增加有关，尚不清楚。

本研究说明松龄血脉康、罗格列酮均能增加ABCA1蛋白的表达〔7〕。发现松龄血脉康组与罗格列酮组ABCA1蛋白的表达无显著性差异，这提示松龄血脉康与罗格列酮有相似的促进ABCA1蛋白表达的作用。并发现松龄血脉康与罗格列酮均能降低细胞内胆固醇含量，且两者有相似的减轻泡沫细胞内胆固醇负荷的作用。行浓度及时间效应研究，发现在一定范围内，较大浓度、较长时间的松龄血脉康增加ABCA1蛋白的表达更多、降低细胞内胆固醇含量更强。因此，松龄血脉康可通过促进泡沫细胞内胆固醇逆向转运过程，减轻细胞泡沫化，最终达到抗AS的作用，松龄血脉康有望成为中医中药领域中新型的抗AS的药物。

1 何菊英，刘松青.一次性密度梯度超速离心分离人血清脂蛋白及无脂血清〔J〕.第三军医大学学报，2002;24(1):46.

2 Brooks WA，Marcil M，Clee SM，et al.Mutations in ABC1 in Tangier disease and familial high-density lipoprotein deficiency〔J〕.Nat Genet，1999;22(4):336-45.

3 苟连平，吕 湛，秦 俭.ATP结合盒转运蛋白A1与动脉粥样硬化〔J〕.心血管病学进展，2007;28(6):951-4.

4 Chinett G，Lestavel S，Bocher V，et al.PPAR-αand PPAR-γactivators induce cholesterol removal from human macrophage foam cells through stimulation ofthe ABCA1 pathway〔J〕.Nat Med，2001;7(1):53-8.

5 苟连平，吕 湛，秦 俭.腺苷三磷酸结合盒转运蛋白A1在动脉粥样硬化中的作用及其受控特点〔J〕.中国组织工程研究与临床康复，2007;11(10):1943-6.

6 王 敏.松龄血脉康治疗稳定型心绞痛的疗效观察〔J〕.华西药学杂志，2002;17(6):466-7.

7 苟连平，秦 俭，吕 湛，等.罗格列酮对急性冠脉综合征患者外周血单核细胞ABCA1蛋白表达的干预〔J〕.重庆医科大学学报，2009;34(6):718-21.