抗痛风胶囊治疗大鼠急性痛风性关节炎及下调TNF-α水平*

于 泓，袁良东#，钟正霞，姚观平，余丽梅，徐尚福，吴 芹

(1.遵义医学院附属医院肾内科 563003;2.遵义医学院附属医院贵州省细胞工程重点实验室 563003；3.遵义医学院贵州省基础药理重点实验室，贵州遵义 563003)

痛风是嘌呤代谢障碍引起的代谢性疾病，其临床主要表现为高尿酸血症、急性关节炎反复发作、痛风石沉积、慢性关节炎和关节畸形及功能障碍、肾实质退行性病变甚至尿毒症。随着人们生活水平的不断提高，饮食结构和生活习惯的改变，其发病率呈上升趋势，已成为危害人类健康的常见病。目前，主要采用秋水仙碱等控制急性痛风性关节炎(acute gouty arthritis，AGA)发作症状，但复发率高,发症难控制，治疗药物不良反应较大[1-4]。

尿酸结石导致关节炎症反应发生是AGA发病的主要机制之一，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)等炎症因子是引起关节炎症反应的关键因子，从而导致关节的红、肿、疼痛。秋水仙碱、糖皮质激素等通过减少炎性介质生成或阻断炎性因子作用，从而缓解AGA临床症状[5]。

抗痛风胶囊(anti-gout capsule，AGC)以祛风通络的中医学理论为基础配制而成，由乌梢蛇、桃仁、红花、枸杞、木瓜、桂圆等中药组成，民间用于治疗AGA，缓解关节炎症及疼痛效果显著。本研究主要在评价抗痛风胶囊治疗AGA疗效的同时，检测TNF-α在AGA大鼠血清、关节液和关节组织中的变化情况，探讨抗痛风胶囊的抗炎作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药物与试剂 AGC由遵义医学院附属医院肾内科提供，0.5 g/粒；秋水仙碱(西双版纳版纳药业有限责任公司生产)，每片0.5 mg(批号 20100502)。尿酸钠结晶(批号 100982303)购于美国Sigma公司， TNF-α ELISA检测试剂盒购于上海西唐生物科技有限公司。吐温80等其他化学试剂均为国产分析纯产品。

1.1.2主要仪器 YLS-TA型足爪容积测量器购于山东省医学科学院设备站，通用酶标仪和KDC-2044低速冷冻离心机分别为美国BIO-RAD公司和科大创新股份有限公司产品。

1.1.3动物 健康雄性SD大鼠50只，体质量240～250 g,第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，SPF级动物合格证号 SEXK(渝)2007-00050。实验前适应性饲养5 d。

1.2方法

1.2.1实验分组 大鼠称体质量、编号，随机分为5组，每组10只，即空白组、模型组、阳性药物组、AGC低剂量、AGC高剂量组。于造模前、后测量大鼠足爪容积，每天测量1次；制备AGA模型同时，每天灌胃给药一次，连续5 d，空白组和模型组给予等容积(1 mL/100 g)生理盐水，阳性药物组给予秋水仙碱0.8 mg/kg，AGC组则分别给予AGC 0.3 g·kg-1·d-1、1.2 g·kg-1·d-1。第5天灌胃2 h后处死大鼠，留取标本，-80 ℃低温冰箱保存待用。

1.2.2AGA大鼠模型制备[6-7]除空白组外，其余大鼠均腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉，仰卧位固定，右踝关节局部消毒，以其外侧后方为穿刺点，穿刺进入踝关节腔，向关节腔注入0.2 mL尿酸钠溶液(尿酸钠结晶250 mg加0.9%氯化钠注射溶液45 mL，再加5 mL吐温80，加热搅拌，配制成尿酸钠溶液50 mL)，以关节囊对侧鼓起为注入标准。空白组注射等容积生理盐水。

1.2.3步态行为学评分[8]观察模型制备后24～48 h AGA大鼠步态变化。评分标准：0分为正常步态；1分为轻度跛行，受试下肢略弯曲；2分为中度跛行，受试下肢刚触及地面；3分为重度跛行，受试下肢离开地面，三足着地行走。

1.2.4关节容积测定 实验前与AGC治疗前后，用足趾容器测量大鼠足趾容积，以反应足踝关节容积，连续监测大鼠关节容积的变化。

1.2.5TNF-α含量测定 AGA大鼠连续灌胃给药治疗5 d处死，取腹主动脉血2 mL，离心、分离血清，备用。另在踝关节上方0.5 cm处剪下含踝关节的足爪，去皮肤后足爪纵切，放入5 mL生理盐水，4 ℃浸泡过夜，留取上清液1 mL。按照试剂盒说明书，采用ELISA法测定光密度值，按标准曲线计算血清和关节液中TNF-α含量。

2 结 果

2.1一般状态 实验期间可见空白组和AGC组大鼠皮毛白而光泽。反应灵敏，饮食及尿便正常。模型组精神、饮食尚可,大小便正常，但体毛稍欠光泽，秋水仙碱组大鼠体毛欠光泽，精神欠佳，懒动，食量减少，少数大鼠出现大便稀溏。

2.2AGC对大鼠步态变化的影响 与空白组比较，模型组大鼠步态评分值明显升高(P<0.01)，活动减少，右下肢弯曲，行走时出现不同程度的跛行，以模型制备后24～48 h变化明显。与模型组比较，秋水仙碱组和AGC各组大鼠活动状态得到显著改善，评分显著降低(P<0.01)，见表1。

表1 AGC对大鼠步态变化的影响

表2 AGC对大鼠关节容积的影响

表3 AGC对大鼠血清TNF-α含量的影响

2.3AGC对大鼠关节肿胀度的影响 以足趾容积变化反应踝关节容积，其值增加表示关节肿胀度增大，结果可见，除空白组外，注射尿酸钠结晶各组，1～5 d，大鼠的踝关节容积均明显高于注射前水平(P<0.01)，存在不同程度的关节肿胀，且关节肿胀度随时间延长，有不同程度的减轻(表2)。与空白组比较，模型组大鼠关节容积显著增加(P<0.01)。与模型组比较，AGC低、高剂量组和秋水仙碱组关节容积均明显降低，但仍高于治疗前水平。

表4 AGC对大鼠关节液中TNF-α含量的影响

2.4AGC对大鼠血清和关节液中TNF-α含量的影响 给药治疗5 d，TNF-α含量测定结果显示，与空白组比较，模型组大鼠血清和关节液中TNF-α含量均明显升高(P<0.05)，经秋水仙碱和低、高剂量AGC治疗后，与模型组比较，AGA大鼠血清和关节液中TNF-α含量明显降低(表3、4)，且抗痛风胶囊与秋水仙碱组TNF-α含量无显著差异。

3 讨 论

大鼠后足踝关节注射尿酸钠结晶制备AGA模型，已被广泛用于痛风性关节炎治疗药物的研究，所引起的症状和病理变化与人体AGA的临床表现极为相似[9]，TNF-α、IL-1β等炎性因子参与了尿酸钠诱导的关节组织免疫炎症反应[10-12]。一般认为中性粒细胞、内皮细胞黏附是急性痛风产生的本质，而TNF-α等可上调内皮细胞选择素活性，增加中性粒细胞的募集，使内皮细胞和中性粒细胞表面的黏附分子相结合，浸润关节部位，释放炎性介质，引起关节局部炎症反应的发生。因而降低AGA患者关节局部TNF-α水平，可减少或终止炎性因子的恶性循环，是AGA治疗的有效措施之一。TNF-α水平的变化既可能反应关节炎症反应的轻重，也是AGA发病的机制，已被用于治疗痛风药物疗效评价的重要检测指标之一[13-15]。此外，TNF-α还可通过诱导前列腺素等致痛物质释放，产生致痛效应。因而减少局部的TNF-α，也可一定程度地缓解局部疼痛。

本实验中，大鼠注射尿素钠结晶24～48 h，已出现明显的踝关节红、肿及步态异常，与文献报道一致[9]，产生了AGA的症状和体征，表明AGA模型制备成功。给予AGC和秋水仙碱治疗后48 h，AGA大鼠踝关节肿胀程度已开始减轻，大鼠步态也有所改善，治疗5 d，上述症状基本消除，关节肿胀程度也减轻70%～90%。表明AGC和秋水仙碱对尿素钠结晶引起的AGA具有明显治疗作用。有研究报道[16]，AGC中的乌梢蛇具有祛风、通络止痉，乌梢蛇体富含的乌梢蛇Ⅱ型胶原蛋白，可明显抑制滑膜细胞炎性因子的水平和活性；木瓜、桃仁等则具有抗血凝、溶栓、解热镇痛等作用[17-18]，上述药物的共同作用，可能是AGC对AGA产生良好治疗作用的基础。

AGA模型组大鼠血清和关节液中TNF-α含量明显升高，说明循环和局部TNF-α水平的升高与AGA的发病关系密切，是重要致炎因子。AGC在迅速缓解AGA大鼠关节肿胀的同时，还将异常增高的血清和关节液TNF-α水平降至正常范围，表明下调循环和关节局部TNF-α水平是AGC发挥治疗作用的主要机制之一，从而有效阻断TNF-α引起的炎症瀑布级联及网络效应，明显减轻关节局部的炎症反应和关节损伤。然而，AGC是否还可调节IL-1β等其他炎性因子的水平，或通过其他途径减轻关节损伤，还需要进一步深入研究。

总之，AGC可迅速缓解AGA大鼠踝关节的肿胀，改善其步态异常，其作用机制与显著降低血清和关节液中TNF-α的含量，减少炎症损伤有关。

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