染色质免疫沉淀分析胰岛β细胞中TCF7L2与GPR40的结合*

毕健琨，任 伟,郑晓雅,许 丹

(重庆医科大学附属第一医院内分泌科 400016)

2型糖尿病(T2DM)属于复杂的多基因疾病，遗传因素与环境因素共同参与发病过程。2006年首次报道TCF7L2，即T细胞转录因子-4(TCF-4)单核苷酸多态性与T2DM显著相关[1]，Weedon等[2]认为TCF7L2 rs7903146位点基因变异型是目前发现的和T2DM发病风险相关性最强的基因型。随后在多范围大样本的研究中得到类似的结果。TCF7L2位于染色体10q25.3，表达产物是高迁移率(HMG)组盒包含的1个转录因子。TCF7L2是T细胞因子/淋巴细胞增强子结合因子(TCF/LEF)之一。

GPR40是G蛋白偶联受体家族(GPCRs)成员之一。它在脑、胰腺、肝、心脏、骨骼肌等均有表达[3-4]，尤其在胰岛、脑组织中表达丰富。GPR40是脂肪酸的特异性受体，脂肪酸作为胞外配体，活化GPR40，激活胰岛β细胞内信号转导途径，调节胰岛素分泌。GPR40在脂肪酸增强GSIS和促进胰岛β细胞过度增殖，进而在引起胰岛β细胞功能缺陷中扮演重要角色。2007年，Reut等[5]发现GPR40与转录因子PDX-1存在特异性结合位点，但是GPR40是否与转录因子TCF7L2存在结合位点，目前尚不清楚。

在后基因组时代，DNA-蛋白质的相互作用是研究基因表达调控的重要领域。染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation，CHIP)，是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的理想方法，利用抗原抗体反应的特异性以及PCR的高灵敏性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组结合的状况，已成为染色质水平基因表达调控研究的最有效方法。本研究拟通过CHIP技术探讨GPR40蛋白与TCF7L2基因是否存在相互作用。

1 材料与方法

1．1材料

1．1．1细胞株 胰岛βTC6细胞购买于中国科学院细胞库。

1．1．2主要试剂和仪器 PAA胎牛血清(德国德图)，DMEM高糖培养基(美国Gibco公司)，TCF7L2的抗体为兔抗人TCF7L2单克隆抗体C9B9(美国Cell signaling technology)，PCR引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。CHIP试剂盒为美国Millipore公司magna chipTMA。超声破碎仪为美国Sonic公司VC750型，PCR仪为美国MJ公司 PTC-200型。

1．2方法

1．2．1胰岛βTC6细胞的培养及细胞的甲醛交连 胰岛βTC6细胞用含20%的胎牛血清的DMEM高糖培养液在37 ℃，5%CO2饱和湿度条件下培养，2 d换液，7 d传代1次。实验时取对数生长期细胞。取1培养皿细胞(10 cm培养皿)，吸掉培养皿中的培养基，加入10 mL 1%甲醛，37 ℃孵育10 min。加入1.25 mol/L甘氨酸1 mL，至终浓度为125 mmol/L，室温下放置2 min。弃上清液，用1 mL冷PBS刮细胞，移至1.5 mL的EP管中，2 500 r/min离心5 min，弃上清，加入800 μL PBS，4 ℃预冷15 min，然后4 ℃ 2 500 r/min离心5 min，重复PBS清洗1遍。然后用包含10 mmol/L HEPES pH7.5，10 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L EGTA，0.75% Triton X-100的溶液清洗细胞一遍，再用包含10 mmol/L HEPES pH7.5，200 mV Nacl，1 mmol/L EDTA,0.5 mmol/L EGTA的溶液清洗细胞一遍。

1．2．2超声破碎 在样品中加入1 mL的lysis buffer(150 mmol/L Nacl 1% Triton X-100,25 mmol/L Tris pH7.5,0.1%SDS,0.5%脱氧胆酸盐),充分混匀，超声震荡，30%功率震荡强度(10 s+60 s)×10次，4 ℃ 2 500 r/min离心5 min，取上清，测蛋白浓度。

1．2．3检验超声破碎效果 取100 μL超声破碎后产物，加入4 μL 5 mol/L NaCl，65 ℃处理2 h解交联。分出一半用氯仿抽提。电泳检测超声破碎后的效果。

1．2．4免疫沉淀 取200～500 μg蛋白，加入80 μL蛋白A琼脂糖/鲑精DNA，室温下放置30 min。4 ℃ 2 500 r/min离心5 min，留蛋白上清总体积的10% 作为input，然后将剩余上清分成2份，分别加目的TCF7L2抗体、阳性对照乙酰化组蛋白H3抗体和阴性对照IgG。4 ℃ 150 r/min放摇床过夜。次日早晨，每样品加入60 μL蛋白A琼脂糖/鲑精DNA，4 ℃放置4 h，4 ℃ 2 500 r/min离心5 min，弃上清液。每管加入500 μL RIPA buffer(150 mmol/L Nacl，50 mmol/L Tris-HCl pH8，0.1% SDS，0.5% Deoxycholat，1 mmol/L EDTA，1% NP-40)，4 ℃放置15 min，4 ℃ 2 500 r/min离心5 min，弃上清液。分别用预冷high salt buffer(50 mmol/L Tris-Hcl pH8，0.1% SDS，0.5% Deoxycholate，1 mmol/L EDTA，1% NP-40，500 mmol/L Nacl)和LiCl buffer(50 mmol/L Tris-Hcl pH8，250 mmol/L Licl，0.1% SDS，0.5% Deoxycholate，1% NP-40，1 mmol/L EDTA)洗胶一遍，用预冷TE buffer(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA)洗胶2遍，弃上清液。

1．2．5蛋白质/DNA复合物的洗脱及DNA的去交联 向胶中加入250 μL Elution buffer(1% SDS，0.1 mol/L NaHCO3)，室温放置15 min，2 500 r/min离心5 min，转移上清液至新EP管，重复洗一遍。取上清液(500 μL)于新EP管，加20 μL Nacl(5 mol/L)，混匀，input加Elution Buffer补体积至500 μL，再加20 μL Nacl(5 mol/L)(如：100 μL input+4 μL Elution Buffer+20 μL 5 mol/L Nacl)一起65 ℃水浴过夜。取出置室温，加入2 μL ProteinaseK(10 mg/mL)，45 ℃水浴1 h。加入等体积(520 μL)氯仿，剧烈震荡10 s，室温，12 000 r/min离心1 min，将含DNA上层400 μL移入新管中，加1/10体积即40 μL 3 mol/L乙酸钠，稍加震荡，加2体积即800 μL 100%预冷乙醇，加1 μL(20 μg) 糖原，震荡混匀，置-30 ℃过夜，充分沉淀DNA。12 000 r/min离心10 min。加入1 mL 70% 乙醇，混匀，12 000 r/min离心5 min，弃上清液，室温干燥至少30 min。加入dH20 50～100 μL， 65 ℃水浴至少30 min。洗脱后的DNA即可进行PCR检测。

1．2．6PCR及琼脂糖凝胶电泳检测 设计GPR40基因引物为5′-CTC ACA GTC CTC CCA GGG TC-3′，5′-CTT CAG TGC GAC ATC GTC TT-3′，预计扩增长度为155 bp。扩增体系为10 μL，PCR Mix 5 μL，超纯水3 μL，DNA模板1 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL。扩增条件，94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环后72 ℃延伸7 min。PCR反应结束后，取4 μL扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，观察并分析结果。

2 结 果

2．1胰岛βTC6细胞株核染色质切割有效性的确定 为了得到合适大小的DNA片段，摸索了不同的超声功率，超声时间的超声破碎条件，最终得到了合适的条件，使得DNA片段长度为100～1 000 bp(图1)。

2．2TCF7L2抗体免疫沉淀DNA模板的PCR扩增结果检测 阳性对照乙酰化组蛋白H3抗体免疫沉淀的DNA为模板，阴性对照以IgG抗体免疫沉淀的DNA为模板，阳性对照条带清晰明亮。而阴性对照看不见扩增产物。结果说明实验中沉淀可信。以TCF7L2抗体免疫沉淀的染色质片断提取的DNA为模板，PCR扩增GPR40，结果显示模板中含有被扩增区段的DNA(图2)。

1：对照(未超声破碎);2、3：超声打断后的染色质。

1：乙酰化组蛋白H3抗体免疫沉淀的DNA;2：TCF7L2抗体免疫沉淀的DNA;3：羊抗人IgG抗体免疫沉淀的DNA;4：DEPC水;M:DNA Marker。

3 讨 论

染色质免疫沉淀技术是基于体内分析发展起来的方法，已经成为表观遗传信息研究的主要方法。它能够较真实地反映体内状态下染色质与基因转录调控因子的结合情况[6]。这种方法与DNA芯片与分子克隆技术相结合，可用于高通量的筛选已知蛋白因子的未知DNA靶点和研究反式作用因子在整个基因组上的分布情况，这将有助于深入了解DNA-蛋白质相互作用的调控网络[7]。

染色质免疫沉淀技术虽然在基因表达调控中发挥了越来越重要的作用，但是该技术操作繁琐、复杂，实验操作对实验结果影响较大，其中DNA片段的大小对实验结果起着较大的影响[8]。DNA片段较大，不利于区分染色质上结合有目的蛋白和没有结合目的蛋白的区域，DNA片段较小不利于PCR扩增。因此，适当的DNA片段大小对于染色质免疫沉淀的结果非常重要，一般认为100～1 000 bp的长度范围是比较合适的。此外，用于染色质免疫沉淀的抗体的质量直接决定实验的成败，一般用于免疫组化和Westeren blotting的抗体不适合用于做染色质免疫沉淀，染色质免疫沉淀需要更高特异性的抗体。抗体的用量也特别重要，抗体用量过多可能会沉淀某些非特异性蛋白，抗体用量过少则特异蛋白沉淀不完全，适宜的抗体量是刚好沉淀经超声剪切的特异性蛋白[9]。只有优化各种实验条件，才能得到较满意的染色质免疫沉淀的实验结果。

胰岛β细胞通过分泌适量的胰岛素来维持机体的需要，这对保持机体的代谢平衡起到了决定性的作用。胰岛素的分泌主要取决于血糖的波动，同时，营养因素，神经传导作用以及激素的相互作用均对胰岛素的分泌产生影响[10]。为了实现其重要的生理作用，胰岛β细胞对某些在该细胞中选择表达的基因进行调控，对这些基因的调控是通过转录控制机制来完成的[11]，这涉及普遍存在的整合机制以及细胞的转录因子[12]。GPR40基因选择性地表达在胰岛β细胞，它对胰岛素分泌起到了重要作用。

研究证实TCF7L2与GPR40与T2DM显著相关。转录因子TCF7L2可以通过改变Wet信号途径来直接影响胰岛β细胞的生物学功能，而且TCF7L2也可以间接引起肠胰岛轴的功能缺陷，包括GLP-1的分泌减少和GLP-1所诱导的胰岛素分泌缺陷和(或)功能障碍。但是，GPR40是通过何种途径调节胰岛素的分泌以及胰岛β细胞功能目前尚不清楚。Del Guerra等[13]研究发现脂肪酸调节了人类胰岛中的GPR40的表达，T2DM患者胰腺中的GPR40的表达量较正常人少，胰岛素的分泌以及胰岛β细胞功能的异常均与GPR40有关。Kebede等[14]认为GPR40不仅能够在脂肪酸刺激的胰岛素分泌中起作用，而且在高脂饮食的情况下对葡萄糖刺激的胰岛素分泌也起作用。Naqasumi等[15]研究发现GPR40可以调节葡萄糖刺激的胰岛素分泌以及体内的血浆葡萄糖水平，同时可以提高普通小鼠以及糖尿病小鼠的糖耐量。Thierry等[16]研究发现GPR40的缺失可以降低胰岛素的分泌，其机制并不是通过影响脂肪酸刺激的胰岛素分泌，而是减少了葡萄糖以及精氨酸刺激的胰岛素分泌，其机制是通过影响肌醇磷酸类的产生。Pang等[17]则认为GPR40介导的胰岛素的分泌，部分是由于刺激了肾上腺素受体所引起的。然而GPR40基因启动子是否与转录因子TCF7L2相互结合，从而影响胰岛素的分泌，目前未见相关报道。

已经证实GPR40与转录因子PDX-1存在特异性结合位点。为了探讨转录因子TCF7L2是否对GPR40基因直接起作用，本研究以TCF7L2抗体免疫沉淀TCF7L2结合的染色质片段，PCR扩增出GPR40基因，该结果证实TCF7L2可与GPR40基因调控区结合，为TCF7L2参与GPR40表达调控提供了强有力的证据。本研究为GPR40如何参与胰岛素分泌找到了新的依据。但是TCF7L2是如何参与GPR40表达调控还需进一步研究。

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