糖尿病大鼠胰岛B细胞损伤的形态定量研究*

文晓红，郭 洋，向 宇，代小思，邓世山

(川北医学院基础医学院，四川南充 637007)

在糖尿病的防治中,选择适当的干预措施保护残存的胰岛B细胞至关重要。目前，在运用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)糖尿病动物模型进行胰岛B细胞损伤的保护性药物筛选方面的研究中，有关药物治疗后胰岛B细胞数量能否恢复的研究报道较多[1-2]，但对胰岛B细胞损伤后如果不采取任何干预措施，其数量随着病程的延长能否自行恢复却很少有研究报道。本实验采用体视学形态定量研究方法，结合血清胰岛素、空腹血糖测量等方法，探讨胰岛B细胞损伤后能否自行恢复，为胰岛B细胞损伤的保护作用方面的研究提供更多的实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 雄性SD大鼠，10～12周龄，体质量280～320 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供。STZ(瑞士ALEXIS公司)；ONETOUCH SureStep微血糖测量仪(中国强生医疗器材有限公司)；稳步医院用血糖试纸(美国LifeScan Inc)；RAT/MOUSE INSULIN ELISA KIT(美国LINCO Research)；抗胰岛素抗体(一抗)及SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；Olympus BX50型生物显微镜(日本Olympus公司)；体视学图像系统(川北医学院与北京驰马特图像技术有限公司及四川大学联合研制)。

1.2动物分组及药物注射 动物分2批进行实验。第1批大鼠38只，随机分为对照组9只，实验组29只；第2批大鼠46只，随机分为对照组10只，实验组36只。自由摄取水和大鼠标准颗粒饲料。将STZ临用前以0.1 mol/L(pH 4.2)的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液溶解。在不禁食的条件下，实验组按60 mg/kg一次性腹腔内注射STZ；对照组一次性腹腔内注射等量的缓冲液。

表1 对照组与实验组的血糖、血清胰岛素和形态定量结果±s)

1.3检测指标 在注射药物前和注射后的第7天(第1批和第2批)和第84天(第2批)，给动物禁食、禁水7 h后测空腹血糖(剪尾取血，用微血糖测量仪及配套的血糖试纸，最大血糖值为27.8 mmol/L，更高的血糖值仪器显示为H，这种情况血糖值被当作为27.8 mmol/L)。在注射药物后第7天(第1批)和第84天(第2批)，取血并分离血清，检测血清胰岛素(ELISA法，操作严格按试剂说明书进行，用Anthos2010酶标仪采用双波长测OD值，根据试剂说明给定的标准曲线计算出相对应的浓度值)。

1.4取材及标本处理 在注射药物后第7天(第1批)和第84天(第2批)，处死大鼠，取出胰腺置Bouin液内浸润固定，70%乙醇脱水，分离胰腺并称质量后，行组织块等距随机抽样，每个胰腺共抽选4个组织块；将4个组织块放入一个包埋盒中用石蜡包埋；每个石蜡包埋块切取5 μm厚的切片1张；进行胰岛素免疫组织化学SABC法染色，操作严格按试剂盒说明书进行。

1.5形态学观察与形态定量 使用Olympus BX50型生物显微镜和体视学图像系统观察切片，记录胰岛内胰岛素免疫组化阳性细胞(胰岛B细胞)核的多少、大小和染色的深浅情况。用体视学方法测量以下指标：(1)胰腺体积：胰腺的质量除以胰腺密度1.021(胰腺的密度用已知浓度、比重的乙醇溶液测得)；(2)胰岛总体积：胰腺体积乘以胰岛的体积分数即胰岛的总体积[3]；(3)胰岛总面积：每张切片随机抽选胰岛(不超过20个)，并利用测试系统软件在图像上随机叠加12×13规则排列的156个测点(点间距25 μm×30 μm)，计数位于胰岛内的总测点数，胰岛内的总测点数乘以每一测点所关联的测面面积(25 μm×30 μm)，就是胰岛总面积；(4)单位面积胰岛内B细胞核数量(NA)：计数随机抽选的胰岛内B细胞核的总个数，B细胞核的总个数除以胰岛总面积即得单位面积胰岛内B细胞核数量。

2 结 果

2.1空腹血糖、血清胰岛素 第1批大鼠的实验组在注射STZ后第7天血糖达成模标准(血糖>11.1 mmol/L[4])的大鼠(成模7 d组)有7只；第2批大鼠的实验组在注射STZ后第7天血糖达成模标准且成活至第84天的大鼠(成模84 d组)有8只。成模7 d组、成模84 d组及其正常对照组在注射药物前和取材前的血糖以及血清胰岛素见表1。

2.2形态学观察与形态定量 对照组所有胰岛内B细胞数量多，占据胰岛的大部分；胰岛素表达强，胞质内含大量棕黄色颗粒；核的大小、形态一致(封3图1)。成模组所有胰岛内B细胞数量减少；胰岛素表达明显减弱，细胞内胰岛素颗粒染色深浅有较大差异；有的B细胞核直径增大(封3图2)。成模7 d组、成模84 d组及其正常对照组的胰腺体积、胰岛总体积、胰岛总面积、B细胞核的总数和单位面积胰岛内B细胞核数量(NA)见表1。

3 讨 论

胰岛B细胞的再生主要包括：(1)B细胞增生：主要来自成体干细胞或前体细胞，胚胎发育晚期及新生期是B细胞增生的高峰期，成年后只有当胰岛受到严重损伤或在大量GLP-1刺激下，干细胞才有可能分化为B细胞。(2)B细胞自我复制：出生以后B细胞数量的维持主要是已有B细胞的复制和凋亡之间的平衡[5]。目前，人们关心的是药物治疗后糖尿病动物胰岛B细胞数量能否恢复，但对胰岛B细胞损伤后如果不采取任何干预措施，其数量随着病程的延长能否自行恢复的报道少。如有研究表明新生大鼠或胎鼠的胰岛B细胞损伤后能够部分恢复[6-7]，另有研究报道，成年大鼠注射STZ后，随着糖尿病病程的推进,通过形态学观察发现胰岛B细胞进一步减少，到6个月时许多胰岛内只残留2～3个B细胞,有的甚至缺如[8-9]。

本实验通过体视学形态定量研究表明，与对照组比较，糖尿病成模大鼠在注射STZ后第7天(成模7d组)的胰岛总体积、胰岛总面积、B细胞核的总数、单位面积胰岛内B细胞核数量和血清胰岛素分别减少了75%、52%、90%、73%和67%(P<0.05)，空腹血糖升高了194%(P<0.05)；第84天(成模84d组)的胰腺体积、胰岛总体积、胰岛总面积、B细胞核的总数、单位面积胰岛内B细胞核数量和血清胰岛素分别减少了13%、89%、76%、94%、79%和92%(P<0.05)，空腹血糖升高了350%(P<0.05)，说明成模大鼠的胰岛B细胞已受到严重的损伤，分泌胰岛素的功能明显降低，空腹血糖明显升高。而成模大鼠的胰腺体积、胰岛总体积、胰岛总面积、B细胞核的总数和单位面积胰岛内B细胞核数量在第7天和第84天差异均无统计学意义；形态学观察在第7天和第84天也无明显区别；血清胰岛素在第84天比第7天减少了71%(P<0.05)；空腹血糖在第84天比第7天升高了30%(P<0.05)，说明成模大鼠的胰岛B细胞受到严重的损伤后，如果不

采取干预措施，随着病程的延长，虽然有新的B细胞形成，但B细胞的自我复制不足以补偿其数量的减少，故B细胞数量不能自行恢复，空腹血糖也没有出现自发性缓解的现象。

另外，本实验还发现，正常成年雄性大鼠胰岛总体积在11～13周龄时为(6.06±1.62)μL3，而到24～26周龄时增长为(10.3±3.47)μL3，增长了70%(P<0.05)，说明胰岛总体积随着动物的年龄增加而增长；正常成年雄性大鼠B细胞核的总数在11～13周龄时为(229±74)个，而到24～26周龄时增加到(350±143)个，增加了53%(P<0.05)，但同时胰岛总面积也增加了82%(P<0.05)，故单位面积胰岛内B细胞核数量在11～13周龄时和24～26周龄时差异无统计学意义，说明单位面积胰岛内B细胞数量不随动物的年龄而增加，推测可能是在非糖尿病状态下B细胞再生与凋亡处于动态平衡所致。

综上所述，给大鼠一次性注射大剂量STZ(60 mg/kg)后，成模大鼠的胰岛B细胞受到严重的损伤，如果不采取干预措施，随着病程的延长，B细胞数量不能自行恢复，空腹血糖也就一直处于高血糖水平。

[1]陈群,陈少强.氨基胍与川芎嗪对糖尿病大鼠胰岛B细胞的保护作用[J].实用临床医药杂志,2010,14(23):1-3.

[2]孙桂荣,綦玉琴,潘青.粉防己碱预防大鼠胰岛B细胞损伤作用的定量分析[J].中华医学杂志,1997,77(4):270-273.

[3]文晓红，张仁东，郭洋，等.胰岛破坏大鼠模型的血糖变化[J].山东医药,2011,51(37):6-9.

[4]Matteucci E,Giampietro O.Proposal open for discussion:defining agreed diagnostic procedures in experimental diabetes research[J].Ethnopharmacol,2008,115(2)：163-172.

[5]柳洁.GLP-1对B细胞再生的影响[J].药品评价,2009,6(6):232-233.

[6]Wang RN,Bouwens L,Klöppel G.Beta-cell growth in adolescent and adult rats treated with streptozotocin during the neonatal period[J].Diabetologia,1996,39(5):548-557.

[7]Yamamoto M,Kudoh A,Arishima K,et al.Immunocytochemical changes in the fetal pancreatic islet following fetal administration of streptozotocin in the rat[J].The Anatomical Record,1999,247(2):248-252.

[8]刘学政,萧鸿.链脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的研究[J].锦州医学院学报,2001,22(4):11-14.

[9]张静,吴靖芳,郑慧娥,等.链脲佐菌素致大鼠糖尿病模型的实验研究[J].河北北方学院学报：医学版,2006,23(4):6-8.