手足口病实验室分型诊断的研究进展

刘仁辉

手足口病(Hand footmouth disease，HFMD)是由多种肠道病毒引起的急性传染病，引起HFMD的肠道病毒有20多种，主要是小RNA病毒科肠道病毒属的一组肠道病毒，其中肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒16型(CoxA16)最常见，其中EV71型感染常导致重症HFMD。EV71手足口病流行以来，多数患儿预后良好，但少数患儿可出现重症病例，易并发无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水肿和呼吸循环衰竭导致患儿死亡以及出现神经系统损害导致身体残疾等.由于此病对婴幼儿和儿童的危害主要表现为重型有较高的病死率和残死率，严重危害儿童身体健康和生命安全，因此被喻为二十一世纪的“脊髓灰质炎”。

我国卫生部于2008年5月2日起，将其列为丙类传染病。资料表明EV71手足口病发病率在我国正逐年大幅度成倍数上升，重型手足口病和死亡人数也明显增多。EV71变异快，存在10多个亚型，各亚型和其它肠道病毒缺少交叉免疫保护作用，因此人群普遍易感［1-4］。该病传播途径复杂，隐性感染者比例大，在婴幼儿之间传染性强，加之目前缺少有效的疫苗，预防措施主要是通过切断传播途径如加强通风、改善个人卫生和早期的报告、隔离、诊治和管理制度等，目前该病的发病机制尚未完全清楚。EV71感染引起的手足口病在临床表现上与柯萨奇病毒、埃可病毒等20多种病毒感染所引起的手足口病难以区别.因此早期明确诊断是何种病毒感染导致的手足口病，对预防和控制EV71传播，早期积极治疗对减少EV71感染引起的严重并发症和减少死亡病例，具有十分重要的意义。本文就手足口病实验室分型检测技术研究进展方面内容进行综述。

1 手足口病的发现和命名

1957年新西兰首次报道导儿童出现以手、足、口腔等部位的皮疹、溃疡为特征的疾病流行，1958年在患儿粪便中分离出柯萨奇病毒(CoxAsckievirus)A16型(Cox A16)，1959年命名为HFMD。人类肠病毒71型最早于1969年首次从加利福尼亚患有中枢神经系统疾病的手足口病婴儿粪便标本中分离出来的［5］，这些病毒可被培养在恒河猴肾脏细胞(rhesus monkey kidney cell;RhMK)及人类胎儿双套细胞中。经由这些细胞培养后纯株化病毒分析，发现会出现典型由肠病毒所致的细胞病变(cytopathetic effect;CPE)现象，由电子显微镜下观察其形态及物理化学特性都与当时已知的其他肠病毒类似.但进行中和抗体试验或免疫扩散试验后，却发现其彼此间并不会有交互作用的现象。因此推测当时所发现的病毒为一种新型的肠病毒。鉴于这种情况，1970年研究者将该病毒视为一种新型肠病毒，命名为肠病毒71型(Human enterovirus 71，EV71)。

2 EV71病原学

2.1 EV71形态结构及基因结构 EV71是小RNA病毒科肠道病毒属成员。由一个非包膜病毒衣壳环绕一个核心组成，EV71的病毒颗粒为二十面体立体对称的球形结构，无包膜和突起，直径大约在24～30 nm。EV71病毒核心为7408个核苷酸的单股正链RNA病毒基因组，基因组中仅有一个开放阅读框，编码含2194个氨基酸的多聚蛋白在其两侧为5’和3’一非编码区(UTRs)，在3’非编码区的末端含有一个长度可变的多聚腺苷酸尾巴(poly-A)。病毒的单链RNA具有感染性，如果去除3’末端的多聚腺苷酸尾或基因组出现断裂，感染性就会消失.该多聚蛋白可进一步被水解成P1、P2、P33个前体蛋白，P1前体蛋白编码VP1、VP2、VP3、VP4 4个病毒外壳蛋白;P2和P3前体蛋白编码7个非结构蛋白(2A～2C和3A～3D).病毒粒子的衣壳由6个亚单位构成，后者又是由4种衣壳蛋白(VP1～VP4)拼装成的五聚体样结构。4种结构蛋白中，除VP4包埋在病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接以外，其它3种结构蛋白均暴露在病毒颗粒的表面，因而抗原决定簇基本上位于VP1～VP3上，病毒衣壳与病毒毒力有关，VP1作为EV71相对保守的衣壳结构，可调节病毒吸附和脱壳，可能成为抗肠道病毒的1种蛋白［6］，VP1蛋白也是主要的病毒中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性.VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性［7］，由891个核苷酸组成的VP1是EV71疫苗发展的主要靶蛋白［8］。

2.2 EV71病毒的感染与复制 EV71病毒的复制发生在宿主细胞浆内［9］，首先病毒与细胞膜表面受体相结合，然后借助细胞的内吞作用进入细胞，或通过与细胞膜进行融合进行脱衣壳而将病毒RNA释放进细胞。由于宿主细胞内缺乏EV71基因组RNA进行复制的RNA聚合酶，所以病毒进入细胞浆后必须首先进行基因组的转录和翻译。EV71病毒的复制与其它正链RNA病毒相似，首先病毒RNA作为mRNA翻译成病毒蛋白，包括RNA复制酶，然后形成RNA的复制中间型(replicative intermediate，RI)，从而合成互补负链，而负链又在复制酶的催化下在细胞内质网中进一步大量合成正链RNA。随着大量病毒正链RNA在细胞浆内的堆积，病毒逐渐进入子代病毒的包装过程。该过程比较复杂，一般首先由5个未切割的P1蛋白相互凝集，P1前体蛋白切割后形成5个形状相同的凝集体，即五聚体(pentamer);然后12个五聚体沿着一个二十面体的12个顶点形成前衣壳，这也即是具有接受RNA分子能力的前毒粒，所以EV71是由60个相同的亚单位组成;最后1AB经宿主酶切割成VP4、VP2，以进一步稳定其结构，产生完全成熟的子代病毒粒子。

3 实验室诊断

3.1 病毒分离 EV71感染诊断的“金标准”是细胞培养分离病毒［10］常用的分离方法有细胞接种和乳鼠接种。患者粪便标本是最常采集的标本，其它如咽拭子或咽喉洗液、脑脊液、疱疹液或血清以及脑、肺、脾、淋巴结等组织标本［11］。70年代中期应用绿猴肾细胞(Vero)培养和新生白鼠接种成功分离病毒，近年来应用人源细胞如W1-38、横纹肌瘤细胞(RD)进行病毒分离。对于所有怀疑含EV71、CA16的标本均需接种到RD和HEp-2(来源于人喉癌上皮细胞)2种细胞系，联合使用上述2种或更多细胞(如Vero细胞)有助于分离到更多的肠道病毒。病毒分离培养对流行病学分析具有重要意义，由于病毒培养耗时，一般需要4～15 d或更长的时间，往往贻误特异性治疗，同时对诊断某些EV血清型的敏感性也欠佳，使得其对临床诊断有一定的限制性，该方法病毒分离的敏感度也依赖于标本的采集、类型、质量以及所用细胞的类型，病毒分离培养对技术要求较高，费用较贵，耗时需要，且各实验室分离阳性率各不相同，属于劳动力复合密集型，无法满足病毒流行期间同时处理大量样本的实际需要.尽管其检测灵敏度比PCR法要低且耗时较长，但对于一些含有PCR抑制因素的样品来说，病毒分离方法也许是唯一的PCR法不能取代的检测方法。

3.2 血清学检测 血清学方法有酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA)、中和抗体检测、补体结合试验(complement fixationtest，CF)等，通过对单份血或急性期和恢复期双份血进行抗体测定作出诊断.但EV血清型繁多，临床使用价值有限，流行病学调查采用比较多。目前国内有间接ELISA检测试剂盒提供，可进行临床患者某些型别肠道病毒的IgM血清学检测而进行诊断，该方法只用急性期单份血清，对临床早期诊断有重要价值。ELISA法快速、经济，应用较为广泛，检测人双份血清标本的中和抗体滴度时通常需用急性期血清与恢复期血清滴度进行比较，抗体滴度≥4倍增高证明病毒感染.由于从病毒感染到抗体出现需要一定时间，因此ELISA法用于疾病的早期诊断灵敏度不高.利用ELISA捕捉法或间接法检测早期患者血清中的IgM和IgG抗体，是较常用的检测指标，ELISA法相对而言简便、快速、不需要非常专业的技术人员，且对实验室的要求也不高，适合用于普通实验室.但是有研究结果显示，ELISA法的敏感性低于PCR法［12］。

手足口病抗体检测的最常用方法目前仍是中和实验，该方法精确且具有型特异性。如做抗体测定，必须采集2份血清标本。第1份(急性期)在发病时尽早采集，第2份在发病后1个月左右采集。临床分析结果时注意:(1)如果检测患者血清中特异性IgM抗体阳性，或急性期与恢复期血清IgG抗体有4倍以上的升高，可为实验室诊断病例。(2)当无法进行病毒分离或得不到适用于病毒分离用的标本时，血清学检测可以为肠道病毒的感染提供一个间接的证据。但是，无症状的肠道病毒感染也是常见的，所以对检测结果的解释要慎重一些。(3)由于IgG抗体产生需要一定时间，而且在感染早期，抗体的浓度亦较低.血清学抗体检测可能滞后于其他检测判断。

3.3 分子生物学检测

3.3.1 逆转录聚合酶链反应RT-PCR PCR技术是一种敏感特异的肠道病毒快速检测分型方法对于疾病的早期诊断及防控具有重大意义。PCR技术自问世后即被用于检测EV几乎可检出所有的血清型，与传统方法相比具有较好的敏感性、特异性和较高的检出率，由于检测材料用量少、快速、灵敏度高且具有很高的特异性，在病毒感染的实验室诊断中起着越来越重要的作用。

近年来，PCR技术已成为诊断肠道病毒感染最常用的一种方法，PCR测序技术则可用于EV71病毒基因分型，可进行大规模的分子流行病学调查。引起手足口病的病毒主要为小RNA病毒科肠道病毒属成员，病毒核酸为RNA，在进行病毒核酸检测时，需首先进行逆转录，将RNA转录成cDNA，然后再进行特异DNA序列的扩增和检测，即RT-PCR方法。应用RT-PCR检测EV71的优点是快速、方便及敏感性高。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术克服了病毒分离培养和血清学方法相对繁杂费时，且在病毒流行期间无法满足同时处理大量样本的缺点，已成为肠道病毒感染快速诊断的重要手段。

3.3.2 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR是在传统RT-PCR的方法上进行改良的方法采用特异性标记的荧光探针，利用荧光信号积累实时测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见“最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA起始浓度进行定量的方法，该检测方法已经被广泛地应用于各种病原的检测［13］。该方法具有不易污染，特异性强，操作简便等优点，可用于手足口病暴发疫情和临床病例的早期高通量快速诊断。经研究表明［14］实时荧光定量PCR法与RT-PCR阳性和阴性符合率均为100%，表明实时荧光定量PCR法特异性与准确性与RT-PCR法相当。与RT-PCR相比，实时荧光定量PCR反应和分析在完全闭管的条件下进行，能有效防止PCR产物的污染，提高检测结果的可靠性;试剂在PCR检测仪上进行扩增和分析，无需电泳和紫外灯观测等步骤，从标本处理开始只需要3～4 h即可完成检测，节省了检测时间。

3.3.3 内标多重荧光 RT-PCR采用TaqMan探针，建立含有监控内标(Internal Control，IC)同时检测EV71和CA16的多重荧光RT-PCR检测方法，内标同步参与样品核酸的提取，不仅能够有效地监控样本中的抑制物，还能避免了操作误差所造成的假阴性.该方法可靠性强，无假阴性结果，能同步检测EV71和CA16。为了对当前暴发的手足口病进行快速准确的检测.肖性龙等［15］研究建立了含内标的同时检测EV71和CA16的多重荧光RT-PCR方法，对该方法的特异性、灵敏度等进行评估，研究表明，该检测方法特异性强，比传统方法的阳性检测率高。另外，实验数据显示，在粪便、直肠拭子、咽喉拭子样本中，PCR抑制物存在的比例为1.8%～3.4%，表明内标对监控PCR抑制物的存在具有重要作用。本方法能同时对EV71和CA16进行快速检测，并且灵敏度高，特异性好，由于加入了内标，能有效地监控假阴性的出现，适合于手足口病的临床检测.

3.3.4 异源双链核酸泳动分析(heteroduplex mobility analysis，HMA) 以EV71的5＇-NTR为模板进行RT-PCR扩增，应用HMA分析扩增产物.优点是通过比较异源双链核酸的泳动模式和核酸序列，准确分析感染病毒是否同一基因型，是否存在变异及变异的程度［16］。也可应用HMA研究流行期间病毒准种及优势株(Major varants)的变化。

3.3.5 RT-PCR联合芯片技术 芯片技术克服了血清学方法常常不能同时准确进行多个病毒分型的缺点，利用它的高通量特性，能同时检测EV71和CA16并进行基因分型.首先需对不同肠道病毒亚型数据库进行精确生物分析，然后设计多个血清型特异的寡核苷酸探针进行病毒检测。Chen TC等［17］应用RT-PCR联合芯片技术检测144例HFMD患者标本，同时所有标本再应用real-time PCR分析，然后由中和实验证实。发现RT-PCR联合芯片技术对EV71和CA16的诊断准确率分别高达92.0%和95.8%。提示这个高度敏感的芯片基础的检测有望成为未来EV71和CA16感染的临床诊断方法。

综上所述，病毒分离鉴定方法繁杂费时，血清学检测方法灵敏度不高，PCR法尤其是多重RT-PCR法灵敏度高，特异性好可靠性强，对于疾病的早期诊断及防控有重大意义，在疫情暴发时，为了提高检测速度和准确性，目前多使用PCR方法。虽然PCR法优点很多，仍无法取代传统的病毒分离鉴定方法，而且PCR法需要昂贵的仪器设备，检测试剂也比前2种检测方法成本高，对于基层医疗机构来说难以推广使用，因此今后需要进一步完善手足口病原体检测技术，特别是快速、准确、操作简单、成本低廉的检测技术。

［1］ Ortner B，Huang CW，Schmid D，et al.Epidemiology of enterovirus types causing neurological disease in Austria1999-2007:detection of clusters of echovirus 30 and enterovirus71 and analysis of prevalent genotypes［J］.JMed Virol，2009，81(2):317-324.

［2］ Fowlkes AL，Honarmand S，Glaser C，et al.Enterovirus-associated encephalitis in the California encephalitis project，1998-2005［J］.J Infect Dis，2008，98(11):685-1691.

［3］ Diedrich S，Weinbrecht A，Schreier E，et al.Seroprevalence and molecular epidemiology of enterovirus 71 in Germany［J］.Arch Virol，2009，154(7):1139-1142.

［4］ Tseng FC，Huang HC，Chi CY，et al.Epidemiological survey of enterovirus infections occurring in Taiwan between 2000 and 2005:analysis of sentinel physician surveillance data［J］.J Med Virol，2007，79(12):1850-1860.

［5］ Schmidt NJ，Lennette EH，Ho HH.An apparently new enterovirus isolated from patientswith disease of the central nervous system［J］.J Infect Dis，1974，129(3):304-309.

［6］ Shih SR，Ho MS，Lin KH，et al.Genetic analysis of enterovirus71 isolated from fataland non-fatal casesof hand，footandmouth disease during an epidemic in Taiwan，1998［J］.Virus Res，2000，68(2): 127-136.

［7］ Brown BA，Oberste MS，Alexander JP，et al.Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998［J］.JVirol，1999，73(12):9969-9975.

［8］ YeoWM，Chow VT.The VP1 structural protein of enterovirus71 interacts with human ornithine decarboxylase and gene trap ankyrin repeat［J］.Microb Pathog，2007，42(4):129-137.

［9］ Zoll J，Heus HA，van Kuppeveld FJ，et al.The structure-function relationship of the enterovirus 3＇-UTR［J］.Virus Res，2009，139(2): 209-216.

［10］Wang SY，Lin TL，Chen HY，et al.Early and rapid detection of enterovirus71 infection by an IgM-capture ELISA［J］.Journal of Virological Methods，2004，119(1):37-43.

［11］赵晓光，郭金鹏，谌志强，等.肠道病毒检测及其抗病毒药物研究进展［J］.中国公共卫生，2007，22(3):375-377.

［12］Marra F，Marra CA，Bruchet N，et al.Adverse drug reactions associated with first-line anti-tuberculosis drug regimens［J］.INT JTuberc Lung Dis，2007，11(8):868-875.

［13］Bustin SA.Absolute quantification ofmRNA using real-time reverse transcription polymerasechain reaction assays［J］.Journal ofMolecular Endocrinology，2000，25(2):169-193.

［14］雷永良，陈秀英，叶碧峰，等.实时荧光定量PCR在手足口病肠道病毒快速检测中的应用［J］.中国病原生物学杂志，2008，3 (10):738-739.

［15］肖性龙，何雅青，余以刚，等.内标多重荧光RT-PCR同时检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型［J］.微生物学报，2009，49 (1):98-104.

［16］Clancy LE，Craig ME，White PA，Rawlinson WD.Human enterovirus isolatesfrom an outbreak typed using heteroduplex mobility analysis［J］.JMed Virol，2005，76(2):215-222.

［17］Chen TC，Chen GW，Hsiung CA，et al.Combiningmultiplex reverse transcriptiont-PCR and a diagnostic microarray to detect and differentiate enterovirus 71 and coxsackievirus A16［J］.JClin Microbiol，2006，44(6):2212-2219.