VEGF121-DFF40融合蛋白原核表达、纯化及体外抗肿瘤活性

张 晶 梁小亮 黄连江 袁玉涛 孙红琰

(厦门市第二医院检验科，福建 厦门 361021)

理想的肿瘤治疗制剂应能选择性诱导肿瘤细胞终末分化，使其彻底失去潜在的生长能力，且对正常细胞无毒性作用。血管内皮生长因子(VEGF)，属 PDGF家族〔1〕，其中 VEGF121方式的不同可能特异的与VEGFR-2结合〔2，3〕，而恶性肿瘤新生血管内皮细胞高表达VEGFR-2;DFF40又称DNA断裂因子40(DFF40)从小鼠淋巴细胞胞质中分离得到的Caspase依赖的脱氧核糖核酸酶(CAD)，二者合称为CAD/DF40，它被认为可能是DNA降解过程中的主要核酸内切酶〔4〕。本研究旨在探讨DFF40与VEGF121结合对新生血管内皮细胞的凋亡作用。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌株 大肠杆菌感受态细胞DH5α、BL21(DE3)均购自博大泰克公司;PET28a菌株由本室保存;PGEM-T载体购自Promega公司。

1.2 试剂、细胞株 Trizol试剂购自Invitrogen公司;AMV RT、PGEM-T载体、PCR产物纯化试剂盒及Random引物购自Premega公司;dNTP购自上海生工;RNAsin Ribonuclease抑制剂、Tag DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、Nde1、Not1酶均购自TaKaRa公司;质粒小量提取试剂盒购自Sigma公司，DMEM购自Gibco公司;MTT试剂购自美国Amresco公司;DMSO购自Sigma公司;HL-60细胞及HUVEC细胞购自协和医科大学基础所细胞中心，肝癌细胞取自武警总医院。

1.3 实验方法

1.3.1 重组表达载体的构建 分别克隆VEGF121基因、DFF40基因，并相连接，VEGF121-DFF40与PGEM-T载体连接，4℃过夜，连接产物转化DH5α，挑菌，鉴定，阳性的克隆送测序。选测序正确的克隆提取质粒，进行Nde1、Not1双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，连接 PET28a载体，4℃过夜，转化DH5α，挑菌鉴定，将阳性的克隆放大培养提取质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)。

1.3.2 诱导表达 将转化大肠杆菌BL21(DE3)的菌进行放大培养，至 OD值为0.6左右时，加入 IPTG至终浓度为1 mmol/L，进行诱导表达，做聚丙烯酰胺凝胶电泳。按不同的IPTG浓度及不同的诱导时间筛选最佳表达参数。大量诱导表达，离心收菌，用含10 mmol/L咪唑的裂解液进行悬菌，加入去氧胆酸钠及溶菌酶、PMSF，混匀放置30 min，再冰浴下超声至液体不再黏稠，4℃离心，分别收集上清和沉淀，将沉淀用洗液悬起来，分别取上清和沉淀进行电泳，进行目的蛋白表达形式的分析，证实主要以包涵体形式表达。

1.3.3 纯化 洗包涵体用1M尿素洗3次，每次洗完进行超声，用6M盐酸胍溶解包涵体，用含50 mmol/L Tris、0.8 mol/L L-arg、2 mmol/L GSH 、0.4 mmol/L GSSG、20 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA的复性液进行稀释复性，用含10 mmol/L咪唑的平衡液进行透析，过亲和层析柱，得到纯化的蛋白。进行Western印迹分析，方法按常。

1.3.4 体外实验 用M199培养液培养HepG2细胞，HUVEC细胞，取对数生长期细胞制成单细胞悬液，调细胞浓度为2×104/ml。将两种细胞加入96孔培养板中，每孔50μl，实验孔加入蛋白终浓度分别为100、75、50、25 μg/ml，对照组加入 PBS，各设3个复孔，继续培养。每孔加入5μg/ml的MTT溶液20μl，继续培养4 h，吸弃孔内培养液，每孔加入DMSO 100μl，震荡摇匀10 min，使结晶物充分溶解。利用酶标仪在595 nm波长处测定各孔的吸光度(A)值，计算细胞生长抑制率(IR)，并绘制生长曲线。

1.4 统计学方法 应用SPSS13.0软件，不同浓度蛋白对肿瘤的影响采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。数据以x±s表示。

2 结果

2.1 基因克隆 琼脂糖凝胶电泳结果表明，分别在500 bp左右及700 bp左右出现条带，与预期结果一致，DNA序列分析结果与文献报道的序列均一致。如图1。

2.2 重组质粒 取测序正确的双酶切产物与表达载体PET28a(+)连接获得的质粒p-VD，转化产物进行PCR鉴定，得到了阳性克隆提取质粒用Nde1及Not1双酶切可得1 200 bp片段，提示构建成功。见图2。

2.3 融合蛋白在大肠杆菌中表达 将转化大肠杆菌BL21(DE3)的菌落挑取斑进行诱导表达，加入 IPTG浓度为1 mmol/L，诱导4 h，如图3，可看到明显表达带。

2.4 纯化及Western印迹结果 用Ni-NTA柱进行纯化，得到了非常纯的目的蛋白见图4，将表达产物进行SDS-PAGE后电转到硝酸纤维素膜上，作Western印迹，结果得到在44 000 D附近的条带，与结果相符，见图5。

2.5 MTT法细胞毒性测定结果 见表1。融合蛋白对两种细胞的直接作用与PBS组均有显著性差异(P＜0.01)，提示此融合蛋白对两种细胞均有直接杀伤作用。当蛋白浓度是25μg/ml时对肝癌细胞的直接作用与PBS组无显著性差异(P＞0.05)，其余各组均有显著性差异，说明从50μg/ml起对肿瘤细胞有直接作用，抑制率约为5%，蛋白浓度是100μg/ml时抑制率为6.5%;而HUVEC组则每个蛋白浓度均与PBS组有显著性差异(P＜0.01)，其抑制率为42%，而当蛋白浓度是100μg/ml时抑制率为71%，明显高于肝癌细胞组。

表1 不同浓度融合蛋白体外直接细胞毒作用OD(x±s)

图1 DFF40及VEGF基因PCR扩增

图2 p-VD酶切质粒电泳图 图3 融合蛋白的表达

图4 纯化的融合蛋白

图5 融合蛋白的Western印迹

3 讨论

目前，恶性肿瘤仍然是威胁人类生命的重大隐患之一，我们期待一种特效抗肿瘤药物的出现。血管内皮生长因子作为内皮细胞特异的有丝分裂原〔5，6〕，在血管发生和形成过程中起重要的调节作用，VEGF在肿瘤的血管形成和维持中也起着重要作用，与肿瘤的生长、转移、预后关系密切，正因为如此，越来越多的研究将VEGF及其受体作为靶点用于肿瘤的治疗。

本研究利用VEGF与DFF40结合的这种特点，成功克隆了目的基因并在大肠杆菌中表达，摸索出一套纯化蛋白的方法，并证明其在体外对肝癌细胞及人脐静脉血管内皮细胞均有杀伤作用，故它作为一种融合蛋白很有可能成为杀伤恶性肿瘤血管内皮细胞的重要物质，为今后大量生产、研究其生物学活性以及将来基因工程药物的研发奠定了基础。

1 Neafeld G，Tessler S，Gitag-Goren H，et al.Vascular endothelial growth faetor and its receptors〔J〕.Prog Growth Fact Res，1994;5(12):89-95.

2 Folkman J，Shing Y.Angiogenesis〔J〕.J Biol Chem，1992;267(4):10931-45.

3 Brooks PC.Cell adhension molecules in angiogenesis〔J〕.Cancer Metastasis Rev，1996;15(6):187-92.

4 Harper SJ，Bates DO.VEGF-A splicing:the key to anti-angiogenictherapeutics〔J〕?Nat Rev Cancer，2008;8:880-7.

5 Konishi S，Ishiguro H，Shibata Y，et al.Decreased expression of DFF45/ICAD is correlated with a poor prognosis in patients with esophageal carcinoma〔J〕.Cancer，2002;95(12):2473-8.

6 Widlak P，Lanuszewska J，Cary RB，et al.Subunit structures and stoichiometries of human DNA fragmentation factor proteins before and after induction of apoptosis〔J〕.JBiol Chem，2003;278(29):26915-22.