健脾养胃方对人胃腺癌SGC7901细胞株的生长抑制和诱导凋亡作用的实验研究

舒 鹏贡婷洁（.江苏省中医院，江苏南京009；.无锡市中医医院，江苏无锡400）

胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居于各种恶性肿瘤的前位[1-2]，对人类的生命和健康造成极大的威胁。我国是胃癌的高发区，预计今后若干年内胃癌的发病率还将持续上升，其防治是当前医学研究的重点和难点，也是我国对重大疾病防治工作的重点领域。化疗是胃癌的重要治疗手段，然而新药、新方案的出现并未能使其有效率显著提高，中医药作为肿瘤综合治疗的手段之一被临床广泛应用。目前普遍认为中医药在预防肿瘤，增强患者的免疫功能，对放化疗的解毒增效，抗复发转移及延长患者的生存期，改善生活质量等方面均有其独特作用。多年来，大量临床研究结果表明，以健脾养胃方为基础的中医药治疗可以降低胃癌术后复发转移[3]，本实验拟对其作用机理进行进一步探讨。

1 实验材料

人胃腺癌SGC7901细胞，由江苏省中医院肿瘤科实验室提供。RPMI1640培养基购自GIBCO公司，新生牛血清购自杭州四季清生物技术有限公司，胰酶蛋白粉、PBS粉、MTT（四甲基偶氮唑盐）购自Sigma公司，二甲基亚砜（DMSO）购自上海凌峰公司。Matrigel胶、AnnexinV-FITC凋亡试剂盒购自美国BD公司。

2 实验方法

2.1 健脾养胃方的制备健脾养胃方由生、炙黄芪，党参，茯苓，炒白术，当归，白芍，陈皮，半夏，三棱，莪术，石见穿，白花蛇舌草，炒谷麦芽，焦楂曲，炙甘草组成。制备方法：将药物加入10倍量水，浸泡1h，加热2h，回收药液，药渣中加入之前一半量的水，再次煎煮2h后，回收药液。合并2次药液，过滤并浓缩至所需浓度，4℃冰箱保存备用 。以上药液由江苏省中医院制剂部提供。

2.2 实验分组实验组：临用前将中药加入RPMI1640培养液，浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL。空白组：不加任何药物。西药组：加入5-Fu。

2.3 实验步骤

2.3.1 酶联免疫检测药物对人胃腺癌SGC7901细胞增殖作用的影响[6-7]在含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中常规培养细胞，在细胞达到指数增长期时开展实验。消化细胞，离心，收集细胞，接种于96孔板，置37℃、5%CO2温箱培养48h，使其贴壁生长。吸弃培养液，加入含有不同浓度药物的RPMI1640培养液200μL，继续培养48h。倾倒培养液，PBS洗2次，每孔加入200μL含10%小牛血清RPMI1640+20μLMTT培养液，继续培养4h。吸掉上清，每孔加入150μLDMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。重复3次。

抑制率＝（1－实验组OD值/对照组OD值）×100%

2.3.2 药物对人胃腺癌SGC7901细胞侵袭力的影响[8-9]按上述方法培养细胞，接种于10cm培养皿中，置37℃、5%CO2温箱培养24h，使其贴壁生长。加入含有不同浓度药物的RPMI1640培养液，继续培养48h。在滤膜的上下表面分别铺以5μgmatrigel，超净工作台中过夜干燥。使用前水化基底膜，将transwell小室放入培养板中。各实验组细胞饥饿处理，重悬于含无血清的培养基中。上室按1×106/mL密度加入200μL细胞悬液，下室加入300μL含10%小牛血清的RPMI1640培养液+300μL趋化因子，常规培养。24h后取出滤[4-5]膜，棉签擦去滤膜上层细胞，移去小室，倒置，风干；滤膜底部加50μL含0.1%结晶紫，风干，PBS清洗；将膜取下，直径上取5个视野，照相，计数。按以下公式计算细胞的侵袭抑制率：

细胞侵袭抑制率=（1-实验组侵袭细胞数/空白组侵袭细胞数）×100%

2.3.3 流式细胞仪检测药物对人胃腺癌SGC7901细胞凋亡的影响[10-11]按上述方法培养细胞，接种于细胞培养皿。继续培养细胞，使细胞贴壁，培养至细胞基本覆盖培养皿底部。倾倒培养液，加入含有不同药物的RPMI1640培养液，继续培养于 37℃、5%CO2温箱。培养48h后，收集细胞培养液，收集所有细胞。加入300μL 1X Binding Buffer缓冲液重悬细胞，将细胞转移至流式管中，加入5μL的FITC Annexin V、5μL 的PI，在避光处轻轻摇晃培养管，孵育细胞15min，25℃。用流式细胞仪检测。

2.3.4 流式细胞仪检测药物对人胃腺癌SGC7901细胞周期的影响[12-13]接种细胞，使细胞贴壁，培养至细胞基本覆盖培养皿底部。倾倒培养液，加入含有不同药物的RPMI1640培养液，继续培养于37℃、5%CO2温箱。培养48h后，收集细胞培养液，用PBS洗细胞2次，消化，收集所有细胞。离心，再用PBS洗细胞2次，吸弃PBS。加入75%乙醇，于4℃固定4h

以上。1500r/min离心5min，弃上清，以3mL的PBS洗涤1次，加入400μL溴化乙锭（PI，50μg/mL），100μL RNase A（100μg/mL），4℃避光孵育30min。用流式细胞仪检测。

3 实验结果

3.1 药物对人胃腺癌SGC7901细胞增殖作用的影响结果见表1。健脾养胃方作用SGC7901细胞48h后，对细胞增殖有显著的抑制作用。高剂量组药物的抑制率可达88.06%，中剂量组的抑制率为56.70%，低剂量组的抑制率为34.24%。经t检验，与空白组比较，差异均有统计学意义（P＜0.005）。

3.2 药物对人胃腺癌SGC7901细胞侵袭力的影响结果见表2。各组药物作用SGC7901细胞24h后侵袭细胞数均低于空白组 （P＜0.001）。空白组细胞轮廓清晰、活力旺盛，各药物组细胞变圆、稀疏，且呈现剂量相关性（见图1）。

3.3 药物对人胃腺癌SGC7901细胞凋亡的影响见表3、图2。健脾养胃方高剂量、中剂量组细胞凋亡数明显高于空白组，并呈浓度依赖性，表现出明显的量效关系（P＜0.01）。

3.4 流式细胞仪检测健脾养胃方对人胃腺癌SGC7901细胞周期的影响 结果见表4、图3。不同浓度健脾养胃方作用48h，可以影响SGC-7901细胞周期分布，使G2/M期比例增

表1 各组药物作用48h后SGC7901细胞增殖抑制率

表2 药物作用24h后各组侵袭细胞数

图1 药物作用24h后各组SGC7901细胞侵袭力 注：A.空白组；B.健脾养胃方低剂量组；C.健脾养胃方中剂量组；D.健脾养胃方高剂量组

表3 药物对人胃腺癌SGC7901细胞凋亡的影响

高，与空白组比较差异显著（P＜0.05）。在健脾养胃方浓度达4mg/mL时，G2/M期细胞比例增至17.64%，在G1峰前可见明显凋亡峰。浓度为6mg/mL中药组细胞死亡较多，结果无意义。

4 讨论

中医学认为，胃癌的发生与六淫、饮食、七情有关，脾胃虚弱是其基本病机，虚、痰、瘀、毒是其主要病理机制。我省名中医刘沈林教授总结多年临床经验，根据胃癌脾胃虚弱这一主要病机，提出以健脾养胃为主的治疗原则，并创健脾养胃方，在临床上治疗胃癌患者，特别是中晚期胃癌患者，取得了较好的临床疗效。该方由炙黄芪、党参、炒白术、当归、白芍、莪术、石见穿、炙甘草等中药组成。方中炙黄芪为补脾益气之要药，党参、白术、甘草取四君子汤之意，益气健脾；莪术、石见穿活血行气消积。全方有健脾养胃、活血化瘀之功，正合胃癌脾胃虚弱之主要病机。多年来，我们运用该方治疗进展期胃癌并进行了大量的临床研究，结果显示其可以较好地缓解消化道肿瘤患者，特别是胃癌患者的临床症状，恢复体力，增加体重，提高免疫功能，减轻其他治疗的毒副反应，降低复发转移，提高生活质量，延长生存期。

本实验以人胃腺癌SGC7901细胞为载体，开展了健脾养胃方对胃癌细胞生长抑制和诱导凋亡作用的研究。实验结果显示：健脾养胃方有抑制人胃腺癌SGC7901细胞增殖的作用，高剂量组对细胞的增殖抑制率最高，达到88.06%；运用健脾养胃方作用细胞24h后，侵袭的细胞数明显减少；该方作用细胞48h后可以诱导肿瘤细胞凋亡，还可诱导肿瘤细胞G2/M期周期阻滞。这一研究结果为健脾养胃方治疗胃癌提供了可靠的实验依据。

在此基础上，我们还将对该方的信号转导通路行进一步的实验研究，以从分子层面深入探讨其作用机制，为中药复方治疗肿瘤提供新的理论依据。

表4 健脾养胃方对人胃腺癌SGC7901细胞周期的影响

图3 健脾养胃方对人胃腺癌SGC7901细胞周期的影响 注：A.空白组；B.1mg/mL健脾养胃方组；C.2mg/mL健脾养胃方组；D.4mg/mL健脾养胃方组

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