血清总补体活性测定的安全模拟方法

王美惠，吴素琴

（辽宁卫生职业技术学院，辽宁 沈阳 110101）

补体是一组经活化后具有酶活性的球蛋白，广泛参与免疫防御与免疫调节功能，因此，血清补体是反映机体非特异性免疫功能的重要指标之一。正常人血清中的补体活性及含量相对稳定，但在某些病理情况下，血清补体水平可发生变化。因此，临床上动态观察血清总补体溶血活性，对一些疾病有辅助诊断的意义[1]。学生在实验室做血清补体活性测定实验时要用人血清，即使是健康人血清也不是十分安全，也可能有其他病毒。为了让学生安全地上好实验课，笔者采用了模拟方法，效果满意，现报告如下。

1 实验原理

绵羊红细胞（SRBC）与相应抗体（溶血素）结合形成的致敏红细胞可通过经典活化途经激活补体，从而导致SRBC溶解。当红细胞与溶血素的浓度恒定时，在规定的反应时间内，补体的量及其活性与溶血程度呈正相关。由于溶血程度在50%左右（30%～70%）时，补体的用量稍有变化就会对溶血程度产生很大的影响，所以通常以50%溶血程度（CH50）作为判定反应终点的指标，而不是用100%溶血程度[2]。

2 试剂与器材

（1）巴比妥缓冲液（PH7.4）。

（2）2%SRBC悬液。取新鲜脱纤维或Alsever液保存绵羊血，加数倍量的生理盐水混匀，2000r/min离心10分钟，弃上清液。如此洗涤3次后，取管底压积红细胞，用巴比妥缓冲液配成2%细胞悬液。为了使悬液浓度标准化，可取2%SRBC悬液0.2ml加巴比妥缓冲液4.8ml稀释25倍，用0.5cm比色杯于721分光光度计542nm波长处比色。调整透光率，要求达到40%。若有偏差，应进行校正。

（3）溶血素（抗SRBC抗体）。按效价用巴比妥缓冲液稀释至2个单位。如效价为1∶4000，使用时稀释至1∶2000。

（4）待检血清（模拟实验用豚鼠血清代替人血清）、生理盐水、蒸馏水。

（5）离心机、试管、刻度吸管、恒温水浴箱、721分光光度计、比色杯等。

3 模拟方法

3.1 豚鼠血清制备

（1）准备几只健康的豚鼠。

（2）用无菌注射器分别对几只豚鼠进行心脏采血，将血液分别放入无菌试管内，置4℃冰箱内过夜。

（3）用无菌吸管将豚鼠血清吸出后全部放在一个无菌的锥形瓶内混匀。

（4）分装：用无菌刻度吸管每次吸取1ml豚鼠血清放入一个无菌的小离心管内，然后把离心管的盖盖好。

（5）将这些小离心管贴好标签后放入纱布袋，放于液氮罐中长期保存；或将小离心管放在小饭盒内，放入-60℃冰箱内，可至少保存两年。

3.2 预实验

（1）实验前取出一支豚鼠血清于室温融化，然后将豚鼠血清用巴比妥缓冲液稀释成 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50等浓度。

（2）以 1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50等浓度的豚鼠血清代替 1∶20的人血清，按照表1所示加入各试剂分别做预实验。

表1 血清总补体溶血活性测定

（3）将每组预实验的反应管以2500r/min离心5分钟后观察结果。用目测法观察各组反应管，并与50%溶血标准管比较，找出溶血程度与标准管最接近的反应管（最好在4～7号管之间），并用该反应管所在预实验组的豚鼠血清的稀释浓度代替1∶20的人血清。如果有几组预实验的结果都符合标准，就选择最大稀释浓度的豚鼠血清代替1∶20的人血清。

（4）记录预实验最佳豚鼠血清浓度，每次实验前取出几支豚鼠血清用巴比妥缓冲液稀释成最佳浓度即可，不必重复做预实验。

4 操作方法

（1）制备50%溶血标准管：取2%SRBC悬液2ml加蒸馏水8ml，SRBC全部溶解，为100%全溶管。取全溶管上清液2.5ml加巴比妥缓冲液2.5ml，混匀，即为50%溶血标准管。

（2）稀释待检血清：吸取新鲜待检血清0.2ml，加入巴比妥缓冲液 3.8ml，将血清进行1∶20稀释。

（3）取试管10支，按顺序编号，然后按照表1所示加入各试剂，将各管混匀，置37℃水浴30分钟后测定补体活性。

5 结果判断

将各反应管以2500r/min离心5分钟后，先用目测法观察各管，并与50%溶血标准管比较，选择溶血程度与标准管最接近的两管，用分光光度计于波长542n m处进行比色。以缓冲液作为空白，校正零点，找出透光率与标准管最接近的一管，根据该管的血清用量，求出总补体溶血活性。

血清总补体活性 CH50（U/ml）=1/血清用量（ml）×血清稀释倍数。

以本法测定的血清总补体溶血活性，CH 50正常参考值范围为 50～100U/ml[1]。

学生采用该方法进行血清总补体活性测定时非常安全，实验效果也较好。

[1]陈敏.临床免疫学检验实验指导[M].4版.北京：人民卫生出版社，2011.

[2]刘辉.临床免疫学与检验实验指导[M].3版.北京：人民卫生出版社，2009.