不同浓度苦丁茶对TCA8113人舌鳞癌细胞的体外抗癌效果

赵 欣，王 强，骞 宇，庞 谅

（1.重庆第二师范学院生物与化学工程系，重庆 400067；2.釜山国立大学食品科学与营养学科，釜山 609-735；3.重庆医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，重庆401147）

苦丁茶（Ilex kudingcha C.J.Tseng）是野生冬青科冬青属苦丁茶种常绿乔木，俗称茶丁、富丁茶、皋卢茶，是我国南方地区经常饮用的一类茶，是传统的药用植物[1]。苦丁茶作为传统饮品和药用植物，在传统医学上具有清热消暑、明目益智、生津止渴、利尿强心、润喉止咳、降压减肥、抑癌防癌、抗衰老、活血脉等多种功效，是一种很好的医药保健饮料[2]。苦丁茶中含有丰富的水浸出物、多酚类物质、氨基酸、胡萝卜素和维生素等，由于这些功能性成分的存在，在近年的研究中已经表明，苦丁茶具有抗菌消炎、调节心血管、生殖和免疫系统的功效[3-5]。此外，还有研究表明苦丁茶对胃癌患者化疗后静脉炎有预防和治疗作用[6]，并且还可以诱导鼻咽癌细胞凋亡，起到抗癌效果[7]。近年关于茶叶在抗癌方面的研究已经全面展开，其中关于苦丁茶抗癌研究也获得了初步结果。为了进一步验证苦丁茶的体外抗舌癌效果，本研究对苦丁茶进行了TCA8113人舌鳞癌细胞体外抗癌功能性的初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

苦丁茶 市售苦丁茶（海南产椰仙牌苦丁茶），为海南野生苦丁茶，在-50℃，2.0Pa下对其进行冷冻干燥后按茶水比1∶10，用沸水每次20min，3次反复提取后用旋转蒸发仪蒸干后得到水提物，将提取物用二甲基亚砜（DMSO）溶解后配制成20%的样品溶液待用；TCA8113人舌鳞癌细胞（TCA8113 Human Tongue Squamous Carcinoma Cells）购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所；DMSO 日本纯正化学株式会社；D-Biotin、L-histidine·HCI（monohydrate）、D-glucose-6-phosphate（mono sodium salt）、NADP（sodium salt）、Paraformaldehyde、4，6-diamidino-2-phenylindole、ethidium bromide 美国Sigma公司；RPMI 1640培养液、Fetal bovine serum（FBS）、0.05%trypsin-0.02%EDTA、100U/mL Penicillin-Streptomycin 美国GIBCO公司；Trizol reagent 美国Invitrogen公司；蛋白检测试剂盒 美国Bio-Rad公司；western抗体 美国Santa Cruz公司。

旋转蒸发仪R-114 瑞士Buchi公司；恒温水浴振荡器HB-205SW 韩国Hanbeak科学株式会社；冷冻离心机VS-15CFN 韩国Vision科学株式会社；二氧化碳培养箱MC096 日本三洋电机株式会社；超净工作台HB-402V 韩国Hanbeak科学株式会社；倒置显微镜PM-1OAK、荧光显微镜BXS0 日本奥林巴斯株式会社；酶标仪Elx800 美国Bio Tekinstruments公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法癌细胞体外增殖抑制实验 将TCA8113人舌鳞癌细胞接种于含10%灭活小牛血清的RPMI 1640培养液中，在5%CO2、37℃充分湿化条件下的培养箱中培养，每周更换2～3次培养基，6～7d传代一次。将培养的癌细胞按1×104个/mL接种于96孔培养板，每孔180μL。5%CO2、37℃充分湿化条件下培养24h。细胞贴壁后按每孔20μL加入样品。孔内实验时，每个样品设三个剂量组，分别为50、100、200μg/mL。48h培养后，每孔加入20μL MTT试剂（质量浓度为5mg/mL）继续培养4h，结束培养后吸弃孔内上清液后，按每孔150μL加入DMSO后振荡30min，540nm波长下用酶标仪测定各孔OD值并计算细胞增殖抑制率。抑制率（%）=[（空白孔OD值一样品孔OD值）/空白孔OD值]×100[8]。

1.2.2 DAPI荧光染色的癌细胞凋亡观察 经样品处理后的癌细胞用PBS洗后用3.7%的多聚甲醛（Paraformaldehyde）常温下固定细胞10min，然后用浓度为1μg/mL的荧光染料4，6-diamidino-2-phenylindole（DAPI，Sigma公司）溶液染色10min。用PBS溶液漂洗染色后的细胞2次，荧光显微镜下进行形态学观察并拍照[9]。

1.2.3 Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）分析 同等条件下用RNAzol试剂制备TCA8113人舌鳞癌细胞总RNA。定量分离到RNA后，以oligo dT为引物，在AMV逆转录酶作用下制备ss cDNA，然后以该cDNA为模板，RT-PCR法扩增Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9基因。RT-PCR引物序列见表1，其中持家基因glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase（GAPDH）作为内参照。实验结束后，以1%琼脂电泳（含浓度溴化乙锭）检查PCR扩增产物[10]。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primers of RT-PCR

1.2.4 Western blot分析 用RIPA细胞裂解液裂解细胞后，分离上清，用蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度。取30～50μg蛋白进行SDS-PAGE分离，电印迹至硝酸纤维素（nitrocellulose，NC）膜上。将印迹的NC膜依次进行封闭、与Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9和GAPDH（Santa Cruz公司）的第一抗体、第二抗体结合，抗体结合区带用化学发光法检测[11]。

2 结果与分析

2.1 苦丁茶的体外抗癌作用实验效果

采用MTT法，检测苦丁茶的体外抗癌效果。如表2所示，苦丁茶水提取物对TCA8113人舌鳞癌细胞具有一定的抑制作用，且抑制效果随样品质量浓度增加而增加。以200μg/mL浓度处理TCA8113人舌鳞癌细胞时，表现出很强的抑制率（75%）。以100、50μg/mL浓度处理TCA8113人舌鳞癌细胞时，癌细胞生长抑制率分别为41%和10%。由此可见，苦丁茶对TCA8113人舌鳞癌细胞具有增殖抑制效果，浓度较高时抑制效果更显著。

表2 MTT法测定苦丁茶对TCA8113人舌鳞癌细胞的生长抑制率的影响（±s）Table 2 Inhibition of the growth of TCA8113 human tongue squamous carcinoma cells by Ilex kudingcha C.J.Tseng as evaluated by a MTT assay（±s）

表2 MTT法测定苦丁茶对TCA8113人舌鳞癌细胞的生长抑制率的影响（±s）Table 2 Inhibition of the growth of TCA8113 human tongue squamous carcinoma cells by Ilex kudingcha C.J.Tseng as evaluated by a MTT assay（±s）

组别OD540（样品浓度，μg/mL）50 100 200抑制率（%）10±2 41±2 75±2

2.2 苦丁茶诱发癌细胞凋亡的效果

DAPI染色后，凋亡细胞核能发出蓝色荧光，通过观察细胞着色情况即可判定细胞是否凋亡。对照组TCA8113人舌鳞癌细胞染色后细胞核边缘清晰，着色均匀。经苦丁茶水提取物不同浓度（50、100、200μg/mL）处理后的TCA8113人舌鳞癌细胞均出现了细胞边缘不规则、细胞核浓染、凋亡小体等典型的细胞凋亡现象，而其中以200μg/mL浓度作用下表现的最为明显（见图1）。可见苦丁茶对诱导癌细胞凋亡具有很强的作用，且以200μg/mL浓度的作用效果明显。

图1 经苦丁茶处理后TCA8113人舌鳞癌细胞的细胞凋亡情况Fig.1 Appearance of apoptotic body in TCA8113 human tongue squamous carcinoma cells treated with Ilex kudingcha C.J.Tseng

2.3 苦丁茶叶对Bax、Bcl-2、caspases基因的mRNA、蛋白质表达影响

苦丁茶水提取物以不同浓度处理TCA8113人舌鳞癌细胞，以200μg/mL浓度处理过的TCA8113人舌鳞癌细胞Bax、caspase-3、caspase-9表达最强，以100、50μg/mL质量浓度处理过的TCA8113人舌鳞癌细胞中Bax、caspase-3、caspase-9表达呈现递减的趋势；Bal-2的mRNA表达中，经不同质量浓度样品处理后，随着浓度的升高表达减弱。由此可以看出，在200μg/mL质量浓度处理下苦丁茶对TCA8113人舌鳞癌细胞的凋亡作用强于其他浓度（见图2）。

图2 经苦丁茶处理后TCA8113人舌鳞癌细胞的Bax、Bcl-2、caspases的mRNA、蛋白质表达Fig.2 Effects of Ilex kudingcha C.J.Tseng on the mRNA and protein expression of Bax，Bcl-2 and caspases in TCA8113 human tongue squamous carcinoma cells

3 结论与讨论

对癌细胞增值的体外作用可以从一定程度上证明保健食品的癌预防效果。本文中随着苦丁茶样品浓度的增加，TCA8113人舌鳞癌细胞的增值减少，证明苦丁茶可以明显地在体外抑制癌细胞的生长。细胞凋亡是在生理或病理条件下，由基因调控的细胞主动程序化死亡过程。在癌症发生过程中凋亡相关基因的突变或表达异常可以阻断癌细胞的凋亡，促使癌症发生[12]。Bcl-2基因是一种原癌基因，具有抑制凋亡的作用。Bcl-2可与促凋亡Bax形成二聚体，Bax相对量高于Bcl-2时，Bax同二聚体的数量增多，从而促进细胞死亡[13]。本研究中随着处理癌细胞的苦丁茶浓度的增加，癌细胞的Bax表达加强，Bcl表达减弱，可以认为苦丁茶可以促进癌细胞的凋亡，从而起到对舌癌的预防作用。Caspase基因选择性地切割某些蛋白质，从而造成细胞凋亡，caspase-9为凋亡途径的上游caspase，caspase-3为下游caspase，caspase-9作为启动性caspase，随着表达的加强可以加强对下游caspase-3的激活，caspase-3可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡[14]。由此可以看出苦丁茶对癌细胞的caspase-3、caspase-9的作用可促进癌细胞凋亡。苦丁茶含有可溶性糖、脂肪、蛋白质和氨基酸等物质，其中黄酮、γ-氨基酸和硒含量较高[15]。黄酮和硒都是有效的抗癌物质，是苦丁茶具有较高抗癌效果的原因[16-17]。本文以市售苦丁茶为基准进行了体外抗癌效能比较实验，得出苦丁茶具有很强的体外抗癌效果的结果。苦丁茶对动物的抗癌效果和对人体的临床作用也有待更深层次的研究。

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