HPLC法测定坤灵丸中芍药苷的含量

2013-09-26 02:35强,王
中医研究 2013年8期
关键词:牡丹皮本品白芍

郭 强,王 梅

(1.河南省食品药品检验所,河南 郑州450003;2.河南省中医药研究院附属医院,河南郑州450004)

坤灵丸是《中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂》第十册中的品种[1],由香附(制)、甘草、白薇、益母草、黄芪、鸡冠花、麦冬、五味子、地黄、红花、川木通、白术(炒)、赤石脂、茯苓、厚朴、肉苁蓉(制)、白芍(酒炒)、荆芥、牡丹皮、阿胶、当归、藁本、红参、鹿角胶、川贝母、没药(炒)、砂仁、延胡索、小茴香(盐制)、龟甲胶、川芎等32味纯中药组成的复方制剂,具有调经止血、逐瘀生新的功能,用于月经不调、行经腹痛、子宫寒冷、久不受孕、习惯性流产等症的治疗。原标准无含量测定项目,通过研究,制定了高效液相色谱法测定白芍和牡丹皮中芍药苷的含量[2]。该方法简便,快速,灵敏,重现性好,可用于该产品质量控制。

1 药品、试剂与仪器

坤灵丸样品由河南广宇博科生物制药有限公司提供,批号为050624,050625,050626。芍药苷对照品由中国药品生物制品检定所提供,为含量测定用对照品,批号为110736-200630;乙腈为色谱醇,供流动相配制用,Merck公司产品;水为超纯水;甲醇为分析纯。安捷伦1 100高效液相色谱仪,配四元泵、自动进样器、VWD紫外检测器,G1314B;KQ-300型超声波清洗器,昆山超声仪器有限公司产品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(实验中用Agilenttm C184.6 mm ×250 mm,5 μm),乙腈 - 水(13∶87)为流动相,体积流量 1.0 mL/min,柱温35℃。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2 000。

在此条件下对芍药苷对照品溶液、坤灵丸供试品溶液进行测定,HPLC色谱结果均较为理想,同法制备的坤灵丸阴性样品(即不含白芍和牡丹皮药材的坤灵丸)测定结果则为阴性,即未见与芍药苷对照品保留时间相一致的吸收峰,说明其他药材对样品测定无干扰。色谱图见图1。

2.2 溶液的制备

对照品溶液:精密称取芍药苷对照品14.96 mg,置100 mL量瓶中,加入甲醇溶液使溶解,并稀释至刻度,摇匀;精密量取10 mL,置100 mL量瓶中,加入甲醇溶液使溶解并稀释至刻度,摇匀,即得(每1 毫升中含芍药苷14.96 μg)。

供试品溶液:取本品适量,除去包衣,研细;取约3 g,精密称定,置具塞锥形瓶中;精密加入甲醇25 mL,称定质量,超声处理(功率 250 W,频率50 kHz)40 min,放冷;再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

图1 芍药苷对照品、样品、缺白芍和牡丹皮药材的阴性样品的HPLC色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

取芍药苷对照品溶液,分别制成浓度为2.34,4.68,9.35,18.7,37.4,74.8 μg/mL 的 6 个样品,分别吸取上述溶液各10 μL进样,按上述色谱条件测定峰面积,以峰面积积分值对进样量进行回归处理,芍药苷在0.023 4 ~0.748 0 μg范围内,呈现良好的线性关系。回归方程为 Y=95.05X+1005.78,r=0.999 99。

2.3.2 精密度试验

取同一芍药苷对照品溶液,按上述色谱条件,连续测定6次(进样量10 μL),测得峰面积积分值分别为 1021.326,1015.941,1016.043,1022.053,1019.959,1019.852,结果平均峰面积积分值为1019.196,RSD=0.26%(n=6)。结果表明:该方法精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

取同一供试品溶液,按上述色谱条件分别在第0,2,4,6,8 h 各进样 1 次,每次进样 10 μL,测得峰面积积分值分别为 1035.405,1040.253,1032.568,1030.476,1042.635,结果平均峰面积积分值为1036.267,RSD=0.49%(n=5)。结果表明:供试品溶液在8 h内稳定。

2.3.4 重现性试验

取同一批号的样品(批号为050624)6份,按含量测定方法试验,结果测得每1 g样品中含芍药苷分别为 0.28,0.27,0.26,0.28,0.27,0.29 mg,结果平均含量为 0.28 mg/g,RSD=3.81%(n=6)。结果表明:该法重现性较好。

2.3.5 回收率试验

精密称取已知含量的本品(批号050626,芍药苷含量 0.30 mg/g)6 份,每份约1.5 g,精密称定,精密加入芍药苷对照品溶液(0.023 9 mg/mL)20 mL,以下按供试品溶液的制备项下方法制备加样供试品溶液。按上述色谱条件测定,结果见表1。计算回收率,平均回收率为 99.66%,RSD=1.56%(n=6)。

表1 芍药苷回收率测定结果

2.4 样品测定

按含量测定方法测定3批样品中芍药苷的含量,结果见表2。

表2 3批样品测定结果 n=3

3 讨论

本文建立了高效液相色谱法测定坤灵丸中芍药苷含量的方法。该方法简便准确,快速灵敏,重现性好,可用于该产品定量控制。

3.1 含量测定方法的建立依据

本方由31味中药组成,功效为调经养血、逐瘀生新,用于月经不调(或多或少)、行经腹痛、久不受孕、习惯性流产、赤白带下、崩漏不止、病久气虚、肾亏腰痛等症的治疗。方中白芍平肝止痛,养血调经,敛阴止汗,用于治疗头痛眩晕,胁痛,腹痛,四肢挛痛,血虚萎黄,月经不调,自汗,盗汗;牡丹皮清热凉血,活血化瘀,用于治疗温毒发斑,夜热早凉,无汗骨蒸,经闭痛经,痈肿疮毒,跌扑伤痛。这两味药功效与本品一致,原标准无含量测定项,参照相关文献[3-10],经试验建立了用高效液相色谱法测定白芍、牡丹皮中芍药苷的含量。该方法操作简便、结果准确,可作为本品成品的质控方法。

3.2 提取条件的选择

根据芍药苷的理化性质,芍药苷在甲醇中溶解度比较大,故选用甲醇作为芍药苷的提取溶剂。对加入甲醇的体积进行了考察并优选合适的加入量,通过比较并考虑到容量管的容量,最后选定甲醇的加入量为25 mL;同时又对超声时间进行了考察优选,超声处理时间比较了20,40,60 min,考虑到将样品中芍药苷提取完全即可,最后确定超声时间为40 min。最后确定加入甲醇25 mL,超声处理40 min能够将本品中芍药苷提取完全,根据实验结果把优选出的方法确定为本品中白芍、牡丹皮中芍药苷的提取方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010:96.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂:第十册[M].北京:中华人民共和国卫生部,1994:84.

[3]王巧,刘荣霞,毕开顺,等.HPLC法测定白芍总苷胶囊中芍药内酯苷、芍药苷和苯甲酰芍药苷[J].中草药,2005,5(11):1630.

[4]冀兰鑫,傅俊曾,黄浩,等.赤芍中氧化芍药苷和芍药苷的含量测定[J].亚太传统医药,2010,8(7):18.

[5]罗云.HPLC法测定归芎合剂中芍药苷的含量[J].内蒙古中医药,2009,18(6):42.

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[10]孟宪波,郑晖.HPLC法测定柴芍丸中芍药苷、栀子苷及丹皮酚的含量[J].中国实验方剂学杂质,2011,17(17):72.

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