16S rDNA测序在儿童血流感染细菌性病原菌分布中的应用

黄君华，张书婉

（1.西安医学院医学技术系，陕西 西安 710021；2.西安市儿童医院检验科，陕西 西安 710003）

16S rDNA测序在儿童血流感染细菌性病原菌分布中的应用

黄君华1，张书婉2

（1.西安医学院医学技术系，陕西 西安 710021；2.西安市儿童医院检验科，陕西 西安 710003）

目的 探讨PCR方法在分析血流感染病原菌分布中的作用，为儿童细菌性血流感染的流行病学调查提供新的思路。方法从儿科重症监护病房（PICU）收集100份疑似血流感染患儿的外周静脉血进行血培养，同时扩增并测序细菌16S rDNA，比较培养结果与PCR结果。结果100份血液标本中11份细菌培养阳性，阳性率为11%；PCR法23份阳性，阳性率为23%，二者比较差异具有统计学意义(χ2=10.08，P＜0.05)；在23例PCR阳性标本中，革兰氏阳性球菌占65.2%，其中表皮葡萄球菌最多(6例，26.1%)，革兰氏阴性菌占34.8%，以大肠埃希菌为主(4例，17.4%)。结论16S rDNA-PCR结合测序的方法可以很好地鉴定血流感染病原菌，与血培养相比能更客观地反映病原菌分布，可作为一种新的流行病学方法在临床应用；儿科重症监护病房血流感染病原菌以革兰氏阳性球菌为主，尤以表皮葡萄球菌最常见。

血流感染；16S核糖体核糖核酸；细菌；测序；儿童

血流感染(Bloodstream Infection，BSI)是一种严重的全身感染性疾病，病原微生物在循环血液中呈一过性、间歇性或持续性存在，并引起机体损害和临床症状[1]。近30年来，随着免疫制剂的广泛使用及侵入性治疗的广泛开展，儿童血流感染的发病率正在日益上升，病死率也很高[2]。目前，血流感染的诊断及病原菌分布的流行病学资料来源主要依靠血培养(Blood Cultivation,BC)，然而由于血培养耗时长，阳性率低，使所得到的统计学资料与客观现实有一定的差距。本研究旨在通过对疑似血流感染标本同时进行培养和16S rDNA通用引物PCR，比较二者的阳性率及病原菌分布上的差异，为儿童细菌性血流感染的流行病学调查提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2012年10月至2013年5月在西安市儿童医院PICU住院的疑似血流感染患儿(发热＞38℃或低体温＜36℃，可伴有寒战等全身中毒症状或中性粒细胞增多伴核左移等)血标本100份；严格按照无菌操作流程采集患儿外周静脉血6 ml，其中2 ml注入BD公司EDTA-K2抗凝管，4 ml注入两瓶儿童专用血培养瓶（2 ml/瓶）。

1.2 方法

1.2.1 细菌总DNA的提取 将2 ml血液标本离心5 min，取沉淀，应用QIAamp Blood DNA Mini Kit试剂盒（QIAGEN，Cat.No.51106），操作步骤按照试剂盒说明书。

1.2.2 PCR扩增 引物序列参照Campbel等[3]和Xu等[4]设计，PSL(f)：AGGATTAGATACCCTGGTAGTCCA，XB4(r)：GTGTGTACAAGGCCCGGGAAC-3，扩增产物大小为615 bp。25µl PCR反应体系，包括：10×buffer 2.5µl，10 mmol/L dNTP 0.25µl，25 mmol/L MgCl22.5µl，3.3µmol/L PSL、XB4各0.5µl，Taq酶(5 U/µl)0.125µl，DNA模板1µl，ddH2O 17.625µl。PCR反应程序：预变性96℃10 min；96℃变性1 min，退火温度55℃1 min，延伸72℃1 min，共30个循环；最后72℃延伸7 min，4℃保存。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳的电压为6 V/cm，采用溴化乙锭(EB)染色20 min，后在凝胶成像分析系统拍照保存。

1.2.3 细菌培养 将儿童专用血培养瓶放入全自动血培养仪BACK-ALERT 3D进行培养，对阳性瓶细菌经VITEK鉴定到种。

1.2.4 测序比对 扩增产物经纯化后送上海生工生物工程有限公司测序，登陆http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/Blast.cgi，将测序结果在GenBank中进行BLAST比对。

1.3 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，采用配对四格表资料的χ2检验对培养和PCR方法的阳性率进行比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 16S rDNA通用引物扩增临床标本 16S rDNA通用引物的扩增产物与预期片段大小(615 bp)相符合(见图1)。

图1 16S rDNA通用引物扩增临床标本

2.2 两种不同方法检测结果 100份血液标本中11份细菌培养阳性，阳性率为11%；PCR法23份阳性，阳性率为23%，二者差异具有统计学意义(χ2= 10.08，P＜0.05)，见表1。

表1 血流感染16S rDNA-PCR与血培养敏感度比较（份）

2.3 PCR与血培养检出病原菌分布 在23例PCR阳性标本中革兰氏阳性球菌占65.2%，其中表皮葡萄球菌最多(6例，26.1%)，革兰氏阴性菌占34.8%，以大肠埃希菌为主(4例，17.4%)，见表2。

表2 16S rDNA-PCR与血培养检测血流感染病原菌分布[株(%)]

3 讨 论

血流感染时细菌侵入血液循环并大量繁殖，是一种严重的细菌感染性疾病。传统血培养不仅是目前诊断血流感染的金标准，而且也是一个重要的流行病学工具，血培养得到的统计学资料（病原菌分布及药敏资料）常作为临床医生经验性治疗的依据。然而，血培养本身存在的局限性导致其所得到的血流感染病原菌分布资料与客观情况有较大的差异。

儿童血流感染以ICU的检出率最高[5]，因此本研究选取PICU患儿作为研究对象，共收集100份血液标本，用细菌16S rDNA通用引物扩增测序，所用引物PSL/XB4具有很高的检测灵敏度，能够达到1.5× 102CFU/ml[6]。100份标本中血培养阳性11例，而PCR方法阳性23例，PCR阳性率(23%)是血培养阳性率(11%)的2.09倍，二者差异有统计学意义，显示PCR方法检测阳性率高于培养方法。

本组资料结果显示，对于PICU患儿，PCR方法检测的病原菌数量和种类多于血培养，以表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和溶血葡萄球菌为主，而血培养方法所检测的病原菌主要是表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和大肠埃希菌。由结果可知，PCR方法所得到的病原菌分布与培养结果略有差异，如果增加样本量并避免假阳性，则PCR方法所得到的统计学结果能更加客观全面地反映血流感染细菌性病原菌分布。

引起血流感染的病原菌种类广泛。近20年来，凝固酶阴性葡萄球菌等革兰氏阳性菌和大肠埃希菌引起的血流感染发病率增加[7]。本研究显示，2012年10月至2013年5月在西安市儿童医院PICU血流感染以革兰氏阳性球菌最多(占65.2%)，这与徐月波等[5]的报道一致，而Abou Elella等[8]的研究认为儿童心脏ICU血流感染主要病原菌为革兰氏阴性菌。本组资料显示表皮葡萄球菌(占26.1%)是PICU血流感染的首位病原菌，这与徐月波及Luthander等[5，9]的报道有一定的差异，而与Lv等[10]的研究一致。在本研究中革兰氏阴性菌占34.8%，以大肠埃希菌为主(占17.4%)，与Al-Hasan[11]的报道一致，其他为非发酵菌(占17.4%)；革兰氏阳性菌以葡萄球菌属为主(占52.2%)，其中凝固酶阴性葡萄球菌占39.1%。上述资料说明不同检测方法、不同年代、不同地域、不同科室、不同年龄段儿童血流感染的病原菌分布有一定的差异。

综上所述，为了获得更加客观真实的血流感染细菌性病原菌分布，本研究直接从全血标本中提取细菌基因组DNA，并应用通用引物PCR扩增细菌16S rRNA基因部分片段，通过测序来鉴定病原菌种类，从而用分子生物学方法得到血流感染细菌菌谱，为得到更加准确完善的统计学资料提供了一种新的思路和方法。此外，细菌性病原菌因时间、地区、科室的不同而有不同的分布，每个地区或医院应该建立自己的血流感染病原菌分布数据库，这可以更好地指导本院合理地诊断血流感染和选择抗生素。

[1] See LL.Bloodstream infection in children[J].Pediatr Crit Care Med,2005,6(3 Suppl):S42-44.

[2]Couto R,Pedrosa T,Tofani.Risk factor for nosocomial infection in a neonatal intective care unit[J].Infect Control Hosp Epidemiol, 2006,27(5):571-575.

[3]Campbell P,Phillips J,Heidecker G.Detection of Pseudomonas (Burkholderia)cepacia using PCR[J].Pediatric pulmonology, 2005,20(1):44-49.

[4]Xu J,Moore JE,Millar BC,et al.Employment of broad range 16S rDNA PCR and sequencing in the detection of aetiological agents of meningitis[J].New Microbiol,2005,28(2):135-143.

[5]徐月波,董 琳,刘 琳,等.儿童医院获得性血流感染的临床特征和病原学分析[J].中华传染病杂志,2013,31(4):221-226.

[6]张 宁,孟 欣,惠凌云,等.细菌性感染PCR诊断方法的建立及其应用研究[J].中华医院感染学杂志,2011,21(14):3079-3081.

[7]魏泽庆,沈 萍,陈云波,等.Mohnarin2011年度报告：血流感染细菌构成及耐药性[J].中华医院感染学杂志,2012,22(24): 5497-5502.

[8]Abou Elella R,Najm HK,Balkhy H,et al.Impact of bloodstream infection on the outcome of children undergoing cardiac surgery[J]. Pediatr Cardiol,2010,31(4):483-489.

[9]Luthander J,Bennet R,Giske CG,et al.Age and risk factors influence the microbial aetiology of bloodstream infection in children [J].Acta Paediatr,2013,102(2):182-186.

[10]Lv H,Ning B.Pathogenesis of bloodstream infection in children with blood cancer[J].Exp Ther Med,2013,5(1):201-204.

[11]Al-Hasan MN,Huskins WC,Lahr BD,et al.Epidemiology and outcome of Gram-negative bloodstream infection in children:a population-based study[J].Epidemiol Infect,2011,139(5):791-796.

Analysis of etiology of bloodstream infection in children by sequencing the 16S rDNA.

HUANG Jun-hua1,ZHANG Shu-wan2.1.Department of Medical Technology,Xi'an Medical University,Xi'an 710021,Shaanxi,CHINA;2. Clinical Laboratory,Xi'an Children's Hospital,Xi'an 710003,Shaanxi,CHINA.

Objective To explore the value of PCR for analyzing the pathogenic spectrum of bloodstream infection(BSI)in children,and to provide a new thought for epidemiological survey of BSI.MethodsA total of 100 patients in PICU with suspected bacterial infections were included,and then performed blood cultivation(BC)and analyzed by 16S rDNA-PCR following by sequencing and BLAST.At the same time,the results of two methods were compared.ResultsAmong the 100 specimens,the positive rate of BC and PCR are 11%and 23%,respectively. There was significant difference between the two methods(χ2=10.08,P＜0.05).Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria accounted for 65.2%and 34.8%,respectively,in 23 bacteria.The predominant pathogens were Staphylococcus epidermidis(26.1%),followed by Escherichia coil(17.4%).Conclusions Compared with BC,16S rDNA-PCR and sequencing which provide a new way of analyzing the pathogenic spectrum of BSI might be effective for epidemiological investigation.The pathogens of BSI are mainly gram-positive bacteria in PICU,and Staphylococcus epidermidis is the most common one.

Bloodstream Infection;16S rDNA;Bacteria;Sequencing;Child

R725.5

A

1003—6350（2014）10—1467—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.10.0564

2013-12-04)

黄君华。E-mail：huangjunhua1985@163.com