骨髓基质细胞植入对脑缺血大鼠海马齿状回突触形成及记忆能力的影响

罗开源，钟小明，余鸿

骨髓基质细胞植入对脑缺血大鼠海马齿状回突触形成及记忆能力的影响

罗开源1，钟小明1，余鸿2

目的探讨骨髓基质细胞(BMSCs)经侧脑室植入脑缺血大鼠后海马齿状回突触形成及大鼠记忆能力的变化。方法大鼠BMSCs培养3代。60只新生Sprague-Dawley大鼠分为假手术组、模型组、细胞组各20只，后两组结扎左侧颈总动脉，细胞组于7 d后经侧脑室植入BMSCs。8周后行Morris水迷宫测试。测试后取脑组织，免疫组织化学染色检测海马齿状回处突触素表达。结果模型组探查训练(T1)和对位探查训练(T2)时间均较假手术组缩短(P＜0.05)；细胞组T1和T2分别较模型组延长(P＜0.05)。模型组大鼠海马突触素阳性细胞积分光密度值(IOD)较假手术组减小(P＜0.05)，细胞组IOD较模型组增加(P＜0.05)。结论BMSCs经侧脑室植入可促进脑缺血大鼠海马齿状回突触形成，并改善其记忆功能。

骨髓基质细胞；移植；缺血；脑损伤；突触；记忆

[本文著录格式]罗开源，钟小明，余鸿.骨髓基质细胞植入对脑缺血大鼠海马齿状回突触形成及记忆能力的影响[J].中国康复理论与实践,2014,20(12):1122-1125.

脑缺血是临床危重症之一，以新生儿及老年人多发，常导致肢体运动功能障碍、智力低下、癫痫，严重威胁人类健康。近年来报道，植入骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)能促进脑损伤大鼠神经元再生，短期内能促进脑损伤大鼠的运动功能。但细胞移植后再生的神经元是否与其他细胞形成联系，以及移植BMSCs对脑缺血大鼠神经功能的中长期疗效还不清楚。本实验将BMSCs经侧脑室植入脑缺血大鼠，通过监测突触标志物变化，探讨脑缺血大鼠海马齿状回突触形成，进一步阐明BMSCs移植治疗脑缺血的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

7日龄Sprague-Dawley大鼠(一级，许可证号：川实动管质第17号)。

1.2 主要实验试剂

兔抗CD44一抗、兔抗CD34一抗、多聚酶联羊抗鼠二抗(PV)试剂盒：北京中杉生物技术有限公司。小鼠抗突触素一抗：杭州华安生物技术有限公司。多聚酶联羊抗兔二抗(PV)试剂盒：北京博奥森生物技术有限公司。

1.3 主要实验仪器

Ax-70荧光显微成像系统：日本OLYMPUS公司。Morris水迷宫跟踪系统：成都泰盟公司。Image-Pro Plus 6.0图像分析系统：MEDIA CYBERNETICS公司。Leica DM IRB荧光倒置显微镜：德国LEICA公司。

1.4 BMSCs的培养和鉴定

全骨髓培养法培养大鼠BMSCs。传代培养3代，制成单细胞悬液，1×105/孔接种到六孔板培养，倒置显微镜下观察。第5天取出盖玻片，多聚甲醛固定，3%双氧水封闭，用兔抗鼠CD44、兔抗鼠CD34多克隆抗体(一抗)、FITC标记的羊抗兔二抗，免疫组织化学法鉴定BMSCs。

1.5 动物分组及造模

60只大鼠分为假手术组、模型组、细胞组各20只。模型组和细胞组大鼠于相对无菌环境下，参照Rice方法，结扎左侧颈总动脉(造模成功率42.7%，造模不成功未列入实验计数)。假手术组仅暴露左颈总动脉，但不结扎。

术后24 h，选1～2只大鼠取脑组织常规HE染色；其余大鼠术后72 h，行大鼠行为学检测。

1.6 侧脑室移植

各组术后继续喂养1周，模型组和假手术组低温麻醉，在脑立体定位系统的指示下(坐标AP-0.5 mm，ML-2 mm，DV-2 mm)左侧脑室注入0.01 mol/L无菌PBS液2 μl；细胞组注入等量105/μl BMSCs。

1.7 Morris水迷宫测试

将喂养至8周龄的大鼠行水迷宫测试。其中获得性训练5 d，第6天行探查训练测试(T1)；然后行对位训练4 d，第11天进行对位探查训练测试(T2)。均记录大鼠在目标象限的搜索时间。

1.8 突触素检测

水迷宫测试结束当天，麻醉后颈椎脱臼处死大鼠，取脑组织，固定、脱水、包埋、切片，免疫组化染色(PV法)，检测左侧齿状突触素回阳性细胞表达。

各切片荧光显微成像系统下照相，400倍下分析海马齿状回颗粒细胞层3个视野(3×5 mm)。Image-Pro Plus 6.0图像分析系统，统计其阳性细胞积分光密度(integral optical density,IOD)值。

1.9 统计学分析

采用SPSS 13.0统计软件分析。对各指标分别作正态分布和方差齐性检验。数据以(±s)表示。组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两两比较用LSD检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 BMSCs的培养和纯化

细胞接种24 h后，倒置显微镜下观察可见大圆形单核细胞贴壁生长。换液后去除大量悬浮细胞。每3天换液1次。36～48 h贴壁细胞逐渐增多。72 h后细胞开始增殖。5～6 d可见细胞增殖形成明显的集落，呈纤维状，10～12 d各集落逐渐融合，细胞呈单层生长。传代后细胞开始变圆，迅速贴壁，伸展成纤维状并且生长加快，细胞可呈现有序的漩涡状生长。传3～5代后杂质细胞逐渐减少，纤维状细胞占99%以上，可用于移植(图1)。

CD44免疫荧光显示，CD44阳性率95%以上，未见CD34阳性细胞(图2)。

图1 第3代BMSCs(倒置显微镜,200×)

图2 CD44阳性BMSCs(免疫荧光染色,200×)

2.2 模型鉴定结果

术后24 h，大鼠脑组织左侧(结扎侧)出现显著病理变化，海马区出现明显神经元坏死。术后72 h出现左侧Horner症；行走困难，向右侧转圈。造模成功。

2.3 Morris水迷宫测试

模型组大鼠T1和T2均较假手术组缩短(P＜0.05)，而细胞组大鼠T1和T2均较模型组延长(P＜ 0.05)(表1)。

2.4 海马突触素表达

突触素阳性细胞胞质为棕黄色，多数细胞分界不清，阳性物质多呈颗粒状分布，且集中于多形层。假手术组阳性颗粒深染、密集；模型组阳性颗粒浅染，数量减少；细胞组阳性颗粒染色较模型组明显增强，阳性颗粒清晰，数量增多(图3)。各组IOD值见表2。

表1 各组Morris水迷宫目标象限的搜索时间(s)

表2 各组大鼠海马突触素表达(IOD)

图3 各组突触素阳性细胞(免疫组化染色,400×)

3 讨论

BMSCs存在于骨髓间质中，具有自我复制和多向分化潜能，在特定条件下能分化成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞和神经细胞等[1-2]。取材方便是BMSCs另一大优点，因此，BMSCs移植治疗神经损伤成为近年的研究热点。

Lu等将BMSCs经静脉注射到脑损伤72 h后的大鼠体内，发现移植的细胞在移植后不同时间迁移到损伤侧大脑皮质，并表达各种中枢胶质细胞标记物，大鼠的运动功能也有明显改善[3]。但目前研究表明，胶质细胞的主要功能是支持、营养神经元和稳定内环境，胶质细胞的增长并不能直接解释损伤大鼠的运动功能改善。

缺血性脑损伤修复不仅需要修复神经细胞，修复的神经元能否与周围细胞建立联系是细胞实现功能的关键[4]。本实验将BMSCs植入缺血性损伤大鼠侧脑室后，突触素免疫组化结果显示细胞组海马齿状回阳性物质较模型组大鼠明显增多。突触素是一种位于突触囊泡膜上的钙结合蛋白，在钙依赖性神经递质释放过程中起重要作用，是突触发生的标志；表达增加说明神经细胞之间形成的突触联系增多。Morris水迷宫提示细胞组大鼠T1和T2均较模型组大鼠延长，说明细胞组大鼠的学习记忆能力较模型组大鼠增强。

BMSCs可能是通过两个途径促使突触增多。①有研究表明，BMSCs注入成体大鼠侧脑室后，转化为神经元[5]，转化后的神经元与周围神经元通过突触建立联系，突触素明显增加。这与Pang等发现移植的BMSCs能直接促进周围神经突生长，且与小剂量超短波可能有协同作用[6]相似。②移植的BMSCs没有转化为神经细胞，而是分泌神经生长因子(nerve growth factor,NGF)、脑源性神经生长因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等，这些因子既可调节自体神经干细胞的增殖、分化[7-8]。其中bFGF、NGF、BDNF等神经营养因子还可以减少脑缺血后缺血半影区神经细胞丢失[9]。

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Effect of Bone Marrow Stromal Cells Transplantation on Synapse Formation in Dentate Gyrus and Memory in Rats with Ischemic Brain Injury

LUO Kai-yuan,ZHONG Xiao-ming,YU Hong.Department of Pediatrics,The First Affiliated Hospital of Gannan Medical College,Ganzhou,Jiangxi 341000,China

ObjectiveTo observe the synapse formation in hippocampal dentate gyrus,and the memory ability after transplanting bone marrow stromal cells(BMSCs)into lateral ventricle of ischemic brain injury rats.MethodsBMSCs from femur of a Sprague-Dawley rat were cultured for 3 generations in vitro.60 newborn Sprague-Dawley rats were divided into sham group(n=20),model group(n=20)and BMSCs group(n=20).The latter 2 groups were ligated the left common carotid artery,and the BMSCs group were injected BMSCs into the lateral ventricle 7 days after ligation.They were tested with Morris's water maze 8 weeks later,and then,the brains were immunohistochemical staining to detect synaptophysin(SY).ResultsThe time of probe trial of acquisition phase(T1)and reveral phase(T2)decreased in the model group compared with the sham group(P＜0.05),and increased in the BMSCs group compared with the model group(P＜0.05).The integral optical density(IOD)of SY positive cells decreased in the model group compared with the sham group(P＜0.05),and increased in the BMSCs group compared with the model group(P＜0.05).ConclusionBMSCs implantation through lateral ventricle can improve the learning and memory ability of rats,which may associated with the synapse formation in dentate gyrus.

bone marrow stromal cells;transplantation;ischemia;brain injury;synapse;memory

10.3969/j.issn.1006-9771.2014.12.006

R743.31

A

1006-9771(2014)12-1122-04

2014-05-12

2014-06-16)

四川省泸州市科技局课题〔No.2008-S-12(4/4)〕。

1.江西省赣南医学院第一附属医院儿科，江西赣州市341000；2.四川省泸州医学院组织与胚胎学教研室，四川泸州市646000。作者简介：罗开源(1966-)，男，江西赣州市人，主任医师，主要研究方向：小儿神经康复。通讯作者：余鸿(1968-)，男，教授，硕士研究生导师，主要研究方向：神经发育生物学。E-mail:617913773@qq.com。