肝癌组织中p-gp170、GST-π、TopoⅡ蛋白的表达

张 亮，隋成旭，宋 磊

（大连医科大学附属第二医院，辽宁大连116027）

肝癌组织中p-gp170、GST-π、TopoⅡ蛋白的表达

张 亮，隋成旭，宋 磊

（大连医科大学附属第二医院，辽宁大连116027）

目的探讨p-gp170、GST-π和TopoⅡ在肝癌组织中的表达及临床意义。方法采取免疫组化法检测35例肝癌组织、20例癌旁组织和10例肝硬化组织中p-gp170、GST-π和TopoⅡ蛋白的表达，并对其与组织病理参数及生存率的关系进行分析。结果肝癌组织中的p-gp170、GST-π的阳性表达率均显著高于癌旁组织及肝硬化组织（P＜0.05）。肝癌组织中TopoⅡ蛋白的表达与癌栓关系密切（P＜0.05）。肝癌组织中p-gp170+GST-π的阳性表达率高于p-gp170+GST-π+TopoⅡ、p-gp170+TopoⅡ、GST-π+TopoⅡ的阳性表达率（P＜0.05）。TopoⅡ阳性表达者的2 a生存率低于阴性表达者（P＜0.05）。结论p-gp170、GST-π在肝癌组织中的高表达，可作为肝癌组织恶变的标志物；TopoⅡ与肝癌的浸润转移及生存关系密切。

肝癌；p-gp170；GST-π；TopoⅡ

原发性肝癌是一种发病率及死亡率均较高的恶性肿瘤，肝癌死亡率在全球死亡率中位居第3位［1］。化疗为肝癌综合治疗的重要组成部分。目前多采用联合方案，凭临床医师的主观判断用药，疗效不理想。肿瘤细胞的耐药性是最主要的原因［2-3］。在糖蛋白介导的多药耐药机制中，肿瘤细胞耐药机制是最常见的原因之一。糖蛋白介导的多药耐药的表达水平在肿瘤细胞中是有所不同的，所以在耐药性方面具备差异［4-6］。多药耐药（multidrug resistance，MDR）在肿瘤细胞耐药中占据着主导地位，在对一种抗肿瘤药物耐药的同时对其他机制不同、结构不同的抗肿瘤药物同时也产生了耐药性。MDR可分为天然性耐药与获得性耐药2种类型，天然性耐药是指在首次使用化疗药物的同时即出现了耐药性，而获得性耐药是指在化疗治疗的过程当中出现的耐药表达。人类主要的这2种基因表达均和 MDR有关［4］。研究［5］发现 p-gp170、GST-π、TopoⅡ等是恶性肿瘤产生多药耐药的物质基础。本研究采用免疫组化法检测p-gp170、GST-π、TopoⅡ在原发性肝癌组织中的表达，并以癌旁组织和肝硬化组织作为对照，以探讨3种因子在原发性肝癌组织中的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集我院2008年至2011年35例术前未行化疗的肝癌患者手术切除的新鲜癌组织、20例相应癌旁组织及10例肝炎后肝硬化活体肝组织标本。所有标本均经病理学检查确诊。35例肝癌中，肝细胞癌34例，胆管细胞癌1例；病理分级：高分化8例，中分化22例，低分化5例；男27例，女8例；年龄26～71岁，中位年龄48.5岁；治疗方案：31例行肝癌切除术，1例行术中射频消融治疗，3例行术中射频消融+经皮酒精局部注射治疗；Fdmondson分级：Ⅰ级5例，Ⅱ级13例，Ⅲ级13例，Ⅳ级4例。除1例围手术期死亡外，余34例术后获得随访，随访率100%，随访时间6～30个月。

1.2 p-gp170、GST-π、TopoⅡ的免疫组化检测方法

采用免疫组化Flivison二步法及DAB显色进行免疫组化染色，其中PV 6001试剂盒和鼠单克隆抗体pgp170、鼠单克隆抗体GST-π、鼠单克隆抗体TopoⅡ均购自福州迈新生物科技有限公司。免疫组化操作按照试剂盒说明进行。

1.3 阳性结果判断的标准细胞内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，细胞膜或同时在细胞质和细胞膜可见pgp170染色，细胞质或细胞核可见GST-π染色，细胞核内可见TopoⅡ染色。采用双盲法随机观察5个不同的高倍镜视野，各计数700个细胞。其染色细胞＞10%为阳性，否则为阴性；p-gp170及GST-π判定标准：（+）＜25%细胞出现阳性着色，（++）25% ～＜75%细胞出现阳性着色，（+++）≥75%细胞出现阳性着色。TopoⅡ判定标准：阳性细胞数＜25%为Ⅰ级，阳性细胞数位于25%～＜50%之间为Ⅱ级，阳性细胞数位于50%～＜75%之间为Ⅲ级，阳性细胞数≥75%为Ⅳ级。三者染色均同时设PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 随访方法统计中生存时间以手术日起至末次随访时间为标准，采用电话和门诊随访，随访时间最长30个月，最短6个月，中位随访时间12.9个月。

1.5 统计学处理采用SPSS 13.0进行数据分析，计数数据比较采用χ2检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 p-gp170、GST-π、TopoⅡ在不同肝组织中的表达gp170、GST-π、TopoⅡ在肝癌组织中的阳性表达率分别为85.7%（30/35）、71.4%（25/35）、31.4%（11/35），在癌旁组织中的阳性表达率为 40.0%（8/20）、35.0%（7/20）、35.0%（7/20），在肝硬化组织中的阳性表达率为20.0%（2/10）、10.0%（1/10）、30.0%（3/10）。其中p-gp170、GST-π在肝癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织及肝硬化组织（P＜0.05）；而TopoⅡ在肝癌、癌旁组织、肝硬化组织中的表达比较差异无统计学意义（P＞0.05）。三者阳性表达情况见图1，多项阳性情况见表1。

2.2 肝癌组织中p-gp170、GST-π、TopoⅡ表达与临床病理参数的关系见表2。

2.3 肝癌组织中p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表达与年龄的关系见表3。

2.4 p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表达与预后的关系

在获得随访的34例肝癌患者中，生存期≥2 a者的p-gp170、GST-π、TopoⅡ阳性表达率分别为66.7%（12/18）、61.1%（11/18）、16.7%（3/18），生存期＜2 a者分别为87.5%（14/16）、75.0%（12/16）、43.8%（7/16）。p-gp170、GST-π阳性表达率在生存期≥2 a者与生存期＜2 a者中比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）；TopoⅡ阳性表达率两者比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 肝癌组织中p-gp170（A）、GST-π（B）、TopoⅡ（C）的表达情况（Flivison，×100）

表1 肝癌组织中p-gp170、GST-π、TopoⅡ表达的关系

3 讨论

肿瘤细胞产生耐药是不同耐药机制协同作用的结果，耐药相关蛋白p-gp170、GST-π、TopoⅡ表达可能在肿瘤细胞多药耐药性的产生中具有重要作用［7］。p-gp170属于ABC簇转运因子，是ABC转运蛋白中的膜糖蛋白，其相关耐药机制是肿瘤内的化疗药物泵入肿瘤细胞外，从而细胞内的化疗药物减少，导致耐药［8］。本组肝癌患者p-gp170阳性表达率高，表明大部分肝癌细胞在化疗前具有p-gp170表达，是肝癌患者原发耐药的主要因素之一。p-gp170是一种钙离子及氯离子通道蛋白，其MDR细胞线粒体跨膜电位降低，与p-gp170表达过度有关［9-10］；可保护耐药细胞，避免其凋亡［11］。p-gp170阳性表达率高即预示着肿瘤预后差或化疗失败的可能性。在体外给药时，p-gp170可减少脑中的药物浓度及中枢神经系统效应［12］。因此，对p-gp170抑制剂的研究是逆转肿瘤细胞多药耐药的重要的组成部分。

表2 肝癌组织中p-gp170、GST-π、TopoⅡ表达与临床病理参数的关系

表3 肝癌组织中p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表达与年龄的关系

GST-π在许多人体恶性肿瘤中有高度表达，与肿瘤的发生、发展有关，被认为是肿瘤的标志酶。GST-π水平可以反映某些肿瘤对化疗药的耐药性，能使肿瘤细胞对某些化疗药物的抗性升高，并且还可抑制烷化剂等化疗药物引起的癌细胞DNA交联，从而造成癌细胞耐药，导致化疗失败［13］。本组资料中GST-π阳性表达率高达71.4%，提示GST-π的表达也是肝癌细胞原发耐药的重要因素。

TopoⅡ是一种核酶，能促进瘤细胞内DNA的合成，使增殖能力提高，与肿瘤恶性程度有关。它是多种抗癌药物作用的靶酶，表达水平下降则肿瘤对抗癌药物敏感性下降，肿瘤细胞耐药性增高［14］。本组中TopoⅡ表达的阳性率为31.4%，说明TopoⅡ表达也是肝癌的原发耐药的因素之一。在有门脉癌栓者的阳性表达率高于无门脉癌栓者，这可能与肿瘤细胞增殖、浸润、转移倾向有关，伴门脉癌栓者具较强的增殖、转移、侵袭能力，所需的TopoⅡ也多，因此阳性表达率高。TopoⅡ阳性表达率2 a内死亡者高于2 a内生存者，说明高表达者预后较差，这可能是肿瘤转移、侵袭能力较高所致。

在研究p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表达情况时发现，三者在肝癌细胞中均有一定的阳性表达率，提示三者在原发性肝癌的多药耐药方面均起着一定作用。其中p-gp170、GST-π有更高的阳性表达率，提示可能其在肝癌的多药耐药方面发挥更大的作用。由肝癌组织、癌旁组织和肝硬化组织中p-gp170、GST-π、TopoⅡ的表达情况可见，前两者在肝癌组织中的阳性表达率显著增高，这提示可作为肝癌组织恶变的标志物。至于TopoⅡ在3种组织中表达无明显差异，提示其在肝癌耐药中的作用不占主导地位。综合分析三者在肝癌组织中的表达，发现 p-gp170与 GST-π、TopoⅡ与GST-π、TopoⅡ与p-gp170、GST-π、TopoⅡ及p-gp170、GST-π、TopoⅡ的阳性表达有关，提示肝癌耐药的调控可能存在共同的诱导机制。本研究结果未发现p-gp170及GST-π与临床分期、病理分级、肿瘤大小、数目、门脉癌栓、肝硬化、生存率等有关。说明p-gp170与GST-π的表达可能仅与肿瘤的耐药性有关，与肿瘤的发展、转移及预后等因素无关。本组资料中p-gp170、GST-π、TopoⅡ阳性表达与年龄无明显关系，但在30～60岁年龄段3种耐药基因的阳性表达较其他年龄组要高，其生物学意义因例数少，尚有待于进一步探讨。某一耐药细胞常有几种机制参与耐药形成［15］。3种耐药基因的综合检测在临床上具备较大意义，一方面明确肿瘤耐药的病因；另一方面依据其原有耐药机制指导临床化疗用药，制定个体化的化疗方案；其次可依据不同的耐药机制，为针对多药耐药的逆转及选择病例提供依据，研究应用逆转剂以增强化疗疗效，延长患者的有效生存期。

综上所述，p-gp170、GST-π在肝癌组织中的高表达，可作为肝癌组织恶变的标志物；TopoⅡ与肝癌的浸润转移及生存关系密切，临床上综合检测p-gp170、GST-π和TopoⅡ意义重大，可以依据耐药机制的不同制定有效的个体化疗方案，研究应用p-gp170、GST-π、TopoⅡ逆转剂可以增强化疗疗效，延长患者的有效生存期。

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Expressions of p-gp170，GST-π，TopoⅡin the Hepatocellular Carcinoma

Zhang Liang，Sui Chengxu，Song Lei
（The Second Affiliated Hospital，Dalian Medical University，Dalian 116027，China）

ObjectiveTo investigate the expressions and clinical significance of p-gp170，GST-π and TopoⅡin the hepatocellular carcinoma.MethodsImmunohistochemical method was used to detect the expressions of pgp170，GST-π and TopoⅡin the 35 cases of hepatocellular carcinoma，the 20 cases of paraneoplastic tissues form hepatocellular carcinoma and the 10 cases of hepatic cirrhosis.The relationship with clinicopathologic parameters and survival rate were comprehensively analyzed.ResultsThe positive expression rate of p-gp170，GST-π in the hepatocellular carcinoma were higher than those in the 20 cases of paraneoplastic tissues and the 10 cases of hepatic cirrhosis（P＜0.05）.The expression of TopoⅡin the hepatocellular carcinoma was related with cancer embolus（P＜0.05）.In the hepatocellular carcinoma，the positive expression rate of p-gp170+GST-π was higher than those of the p-gp170+GST-π+TopoⅡ，the p-gp170+TopoⅡ，the GST-π+TopoⅡ（P＜0.05）.The 2-year survival rate of the hepatocellular carcinoma with TopoⅡpositive expression was lower than that of the hepatocellular carcinoma with TopoⅡnegative expression（P＜0.05）.Conclusionp-gp170，GST-π are higher expressions in the hepatocellular carcinoma，and can be the marker of hepatocellular carcinoma；TopoⅡ may be relative to imbibition and survival of the hepatocellular carcinoma.

hepatocellular carcinoma；p-gp170；GST-π；TopoⅡ

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.06.005

R735.7；R730.23

A

1673-5412（2014）06-0472-05

2014-03-27）

张亮（1983-），男，硕士，医师，主要从事肿瘤介入治疗研究。F-mail：zlwy198335@163.com

宋磊（1975-），男，主任医师，主要从事肿瘤及肿瘤介入治疗研究。F-mail：songlei_1975@126.com