响应曲面法提取阿里红中总三萜酸成分

张慧锋，郭淑英，申 蕾，付 非 (吉林医药学院药学院，吉林 吉林 132013)

阿里红(FomesofficinalisAmes)，又名苦白蹄，属于担子菌纲(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceace)、层孔菌属(Fomes)[1]。新疆《维吾尔医常用药材》一书中称阿里红为“落叶松茸”，用维吾尔语音译为“哈里坤”。阿里红是我国新疆地区维吾尔民族医生常用的治疗药物之一， 民间验方也用以治病。从阿里红中分离得到的化合物主要有三萜酸类、倍半萜类、多糖及直链烷烃等,其中三萜酸类的化合物含量最高。

目前，传统的三萜酸类化合物的提取方法主要有水提法、醇回流提取、碱性水或稀醇提取与其他有机溶剂萃取的方法等等，以上方法[2]被广泛应用于三萜酸类化合物的提取，费时、费材料，不利于节约资源、经济生产。因此本研究不采用回流提取法，而是采用目前较常用、并可以用于工业生产的超声提取法，研究阿里红三萜酸类化合物的提取工艺。

响应面设计法(Response Surface Methodology，RSM)是一种统计设计试验技术的合成方法，将回归方法用作函数估算的工具，利用试验结果与多因子试验中各个因子之间的相互关系，以及多项式中的近似因子之间的关系得到相应的函数，再通过合理的试验设计，尽量能以相对比较少的试验项目、较短的试验时间和最经济实用的试验方式对整个实验进行全面的研究，科学地分析整体和局部之间的关系，进而得到明显的、有目的的结论[3]。

研究发现，三萜酸类化合物提取效果与提取温度、时间、超声波功率等有密切关系。本实验在单因素实验的基础上，利用响应曲面法中心组合设计，最终确定阿里红中三萜酸类化合物提取的最佳工艺。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

阿里红药材购于新疆维吾尔医医院;

高氯酸、香草醛(天津市大茂化学试剂厂),乙醇(95%,天津市永大化学试剂开发中心),齐墩果酸的对照品(上海市融禾医药科技有限公司,批号080921),冰醋酸(北京化工厂)。

Rotavapor R-3旋转蒸发器(瑞士BUCHI),KQ-250DE型数控超声波清洗仪(昆山超声仪器有限公司),BSA623S-CW型电子天平[北京赛多利斯科学仪器(德国)有限公司],GZX-DH-50X55-S型电热恒温干燥箱(上海市跃进医疗机械厂),DK-98-1型数显电子恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司),SHZ-D(Ⅲ)循环式多用真空泵(郑州亚荣仪器有限公司),1700紫外分光光度仪(日本岛津)。

1.2 紫外分光光度法测定总三萜酸的含量

1.2.1 确定显色方法

根据相关文献，高氯酸-香草醛比色法适用于各种三萜酸的显色，因此，本实验选用此法显色，然后对样品进行紫外检测。

1.2.2 选择检测的波长

精密称取齐墩果酸对照品5 mg置于25 mL容量瓶中，乙醇溶解并定容至刻度，就可以得到齐墩果酸的对照品溶液，溶液的浓度是0.2 mg/mL。

精密移取供试品与对照品溶液0.6 mL置20 mL带塞的试管中，挥去溶剂，然后加入新配制5%香草醛-冰醋酸0.4 mL和高氯酸1.6 mL，置70 ℃恒温水浴中加热15 min，然后冷却至室温，再精密加入冰醋酸8.0 mL，摇匀，于400～800 nm范围下扫描波长，从图中得到最大吸收波长。

1.2.3 标准曲线的制备

将精密吸取的齐墩果酸对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于试管中，用水浴将乙醇挥干，加入1.6 mL高氯酸，0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，放置于70 ℃恒温水浴中，加热反应15 min，然后冷却至室温，然后再分别加入8.0 mL冰醋酸溶液，用超声将其混匀。以空白样品为参照，使用紫外分光光度计，于波长547 nm处测得吸光度值。然后将齐墩果酸的质量作为横坐标，测得的吸光度值作为纵坐标，建立相应的标准曲线。应用最小二乘法做线性回归，可以得到相应的回归方程。

1.2.4 样品中总三萜酸含量的测定

取在不同的条件下提取的阿里红浸膏150 mg，然后用乙醇溶解，置于100 mL容量瓶中定容至刻度线。精密量取上述溶液0.5 mL，放置水浴中直至溶剂完全挥去，然后再分别加入0.4 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液，1.6 mL高氯酸并混匀，放置70 ℃的恒温水浴中反应15 min，冷却至室温，再加8 mL冰醋酸并混匀，用紫外分光光度法(Ultraviolet spectrophotometry，UV)于波长547 nm处测得吸光度值，然后代入1.2.3中得到的标准曲线中,并计算得到的三萜酸含量。

其中：C(mg/mL)—测定样品液的浓度

V1(mL)—测定时稀释的体积

V2(mL)—样品溶液定容后的体积

V0(mL)—测定吸光度时所用的样品液体积

W(mg)—原药材质量

1.3 方法学考察

1.3.1 精密度试验与重复性试验

按照1.2.4中应用的方法，平行操作测试5组样品，具有重复性的试验可以用于评价测定方法，确定其可靠性，选取其中的一组平行地连续测定5次，然后进行精密度的考察，测定所得结果间接近的程度[2]。

1.3.2 稳定性试验

准确吸取供试品溶液一份，再分别按照1.2.4项的方法操作，在60 min内每隔10 min测定相应的吸光度值，考察显色的稳定性[2]。

1.3.3 加样的回收率试验

量取9份已知含量的供试品溶液，置于具塞的试管中，再分别加入对照品溶液，按1.2.4中的方法显色并测定吸光度，最后计算其中三萜酸的含量，计算得平均回收率。回收率试验一般用于评价测定方法的准确性[2]。

1.4 优化超声波提取工艺

考虑不同的因素对三萜酸提取率的影响，三萜酸类化合物提取效果主要与提取温度、时间、超声功率有密切关系，因此本研究对超声时间、超声温度、超声功率进行了单因素试验，然后利用响应曲面法确定最佳提取条件。

1.4.1 单因素实验

超声波提取的影响因素比较多，在进行预实验时，考察了超声功率、提取时间、提取温度对提取率的影响，发现对结果影响较大。所以在实验中，超声功率、提取时间和提取温度将作为考察因素。超声提取的温度分别设为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃,超声时间分别设为10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，超声功率分别设为100 W、150 W、200 W和250 W。

1.4.2 响应面优化实验设计

采用Design Expert软件(8.05b)进行设计，并采用Box-benhnken设计试验法进行优化得到最佳的提取方法，共选取超声功率、提取时间和提取温度作为3个主要的因素，并且将其作为自变量，响应函数为总三萜的得率，通过响应曲面分析法，得到回归方程，最终得出自变量和响应函数之间的统计学模型，以确立阿里红总三萜提取的最佳的工艺参数。

在本试验中，以超声功率、提取时间、提取温度作为三个关键的考察因素也就是自变量，三个自变量分别设为X1、X2、X3，并且分别用-1、0、+1来表示自变量的低、中、高水平，然后再按照相应方程式x=(Xi-X0)/ΔX对自变量进行编码，方程式中x代表自变量的编码值，Xi代表自变量的真实值，ΔX代表自变量的变化，因素编码及水平见表1。

表 1 因素编码水平表

预测模型是以阿里红总三萜酸的最终得率Y作为响应值(评价指标)，此模型得到的二次多项式方程是由最小二乘法拟合而得的

上述方程式中，Y代表预测响应值,β0代表常数值,βi代表线性系数,βii代表二次项系数,βij代表交互项系数。

1.5 数据统计分析

2 结 果

2.1 UV测定三萜酸含量的方法的建立

2.1.1 确定最佳测定波长

利用高氯酸-香草醛显色法，即1.2具体步骤操作，然后选择400～800 nm进行波长扫描，结果见图1，从图中可以看到齐墩果酸对照品溶液在547 nm 处和611 nm处有最大吸收峰，文献多采用547 nm为阿里红三萜酸的紫外检测波长，因此本研究选用547 nm为阿里红三萜酸的紫外检测波长。

2.1.2 标准曲线的绘制

以齐墩果酸含量为横坐标，对应的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。结果见图2，得到的回归方程为：Y=28.436X-0.009 2，R2=0.996 8。

从图2可以看出，不同浓度的齐墩果酸对照品溶液与测得的吸光度值成良好的线性关系，相关系数R2=0.996 8，因此此方法可以用作阿里红三萜酸含量测定方法。

图 1 齐墩果酸的UV波长扫描图

图 2 齐墩果酸标准曲线

2.2 方法学考察结果

2.2.1 精密度与重复性结果

用高氯酸-甘草醛法显色UV测定阿里红总三萜酸含量，精密度相对标准偏差(RSD)为0.23%，说明使用的测定方法精密性与准确性良好，而且测定条件易操作，可控性强，测定结果可信。

2.2.2 稳定性试验结果

样品加入显色剂后在60 min内检测，其吸光度值变化相对稳定，RSD为0.45%。表明显色稳定，一定时间内测定不会对三萜酸含量产生影响。

2.2.3 回收率实验结果

平均回收率为99.91%，RSD为0.48%，表明测定所得的结果与真实数值较为接近，准确度较高。实验数据说明该显色方法测定阿里红总三萜酸含量符合微量成分分析的要求，具有一定的实用价值,具体结果见表2。

表 2 回收率结果(n=9)

2.3 超声波工艺确定结果

2.3.1 单因素实验的结果与分析

为了更好地确定阿里红三萜酸的提取条件，将几个影响最终提取率的主要因素进行了单因素考察，结果如下。

(1)超声功率对总三萜酸的得率的影响

超声提取时间为30 min，提取温度为30 ℃，选择不同的超声功率，对阿里红总三萜酸的得率影响见图3。如图3所示，当超声功率设为200 W时，总三萜酸的最后得率最高。当超声功率小于200 W时，随着超声频率的升高，总三萜酸的得率也逐渐升高；而当超声功率一旦超过了200 W时，随着超声功率的进一步增加，总三萜酸得率却逐渐地下降。因此，超声功率选择为200 W是最佳条件。

(2)超声时间对提取得率的影响

超声提取温度为30 ℃，提取功率为200 W，选择不同的超声时间，对阿里红总三萜酸的得率影响见图4。如图4所示，当超声的时间设为30 min时，阿里红总三萜酸的提取得率最高。当超声处理的时间超过30 min时，总三萜酸就会出现损失的现象，其提取得率会明显下降，这说明阿里红总三萜酸的提取过程与超声的时间密切相关，所以选择最佳提取时间为30 min。

(3)超声温度对提取得率的影响

超声提取时间为30 min，超声功率为200 W，选择不同的提取温度，对阿里红总三萜酸的得率影响见图 5。如图5所示，当超声提取的温度低于40 ℃时，升高温度可以使总三萜酸得率出现上升的趋势，当温度达到40 ℃时，阿里红总三萜酸的得率达到了最大值。此时，继续升高提取温度，总三萜酸的得率却出现了下降的趋势。据此，提取温度设为40 ℃，是最适宜的温度。

图 3 超声功率对超声波提取阿里红总三萜酸得率的影响

图 4 超声时间对超声波提取阿里红总三萜酸得率的影响

图 5 超声温度对超声波提取阿里红总三萜酸得率的影响

2.3.2 响应面分析法优化阿里红总三萜酸超声提取工艺

根据RSM的设计，共选取17个试验点，将超声的功率、时间和温度3个主要因素设为自变量，最后以总三萜酸的得率作为RSM的响应值。表3是得率试验值和模型预测值。将结果进行了二次多项回归拟合，最终获得了预测响应值Y(得率/%)和功率(A/W)、提取时间(B/min)及提取温度(C/℃)的一个二次回归方程：

Y=14.87+1.250E-003X1+0.75X2+0.49X3-

在此二次模型中，回归系数的显著性检验(表4)表明：主要因素X1、X2和X3对总三萜酸的提取效果的线性效应都比较显著;另外，因素X12和X22对总三萜酸的提取效果的曲面效应比较显著，而X1X2、X1X3和X2X3对总三萜酸的提取效果的交互影响并不显著。

表 3 阿里红中总三萜酸得率实测值与模型预测值

表 4 回归方程系数显著性检验

(1)超声提取阿里红总三萜酸的等高线和响应面分析及优化

图6可以得出，当超声提取温度保持不变为40 ℃时，提取功率与时间有明显的相互影响作用。当超声提取温度不变时，延长超声的提取时间，总三萜酸的得率会先升高后下降，得出一个峰值；当超声提取功率在中间水平条件时，总三萜的得率变化比较大；当提取时间在中间水平时，总三萜酸的得率相对较大;而在提取的时间不变时，超声功率也同样有上述规律。分析图7可以得到，当超声功率处于中间水平，提取时间也处于中间水平时，就可以获得比较高的得率。

从图7得出，超声提取时间为30 min不变时，增加超声功率与提升超声提取温度，总三萜酸的得率会先增加后减少，中间出现一个峰值。当超声提取的功率固定时，超声提取的温度逐渐上升时，总三萜酸的得率也随之增加。出现这些现象的原因是，超声提取温度的提高能够加快分子解离与扩散的运动速度，进一步加快总三萜酸的析出速率,并最终提高总三萜酸得率。

图8表明，当超声功率为200 W时，总三萜酸的得率会随着超声的温度与时间的变化而变化，出现先上升后下降的趋势。这是因为超声可以破碎阿里红的细胞，从而将细胞内的阿里红总三萜酸提取出来，但是超声时间过长就可能影响到其化学结构，进而降低阿里红总三萜酸的得率。

(2)确定阿里红总三萜酸最佳提取条件与验证实验

根据回归模型，在选取的各个因素的范围内，应用Design-Expert软件分析可得出，超声波辅助提取阿里红总三萜酸的最优工艺是：超声功率245.2 W、提取时间34.3 min、提取温50.0 ℃，阿里红总三萜酸得率的预测响应值是14.89%。最后考虑到条件的可控性，得到最优的阿里红总三萜酸的超声提取工艺是：超声功率250 W、提取时间35 min、提取温度50 ℃。最后我们用最优的超声提取工艺做了三次平行试验，计算得出平均的阿里红总三萜酸提取率是14.88%，与预测的提取得率14.89%近似相等，验证了我们的预测结果，说明以上的回归方程和实际情况拟合较好，充分地验证了所建模型的正确性，说明响应曲面法适用于阿里红总三萜酸的超声提取工艺的回归分析及参数优化。

图 6 超声功率和提取时间交互影响得率的响应面图及等高线图

图 7 超声功率与提取温度交互影响得率的响应面图及等高线图

图 8 提取温度与提取时间交互影响得率的响应面图及等高线图

3 讨 论

由于具有多种结构类型和生理活性作用，真菌的代谢产物成为开发利用新的天然来源药物的一个很重要的来源。我们国家的真菌资源十分的丰富，为了更好地开发利用和更好地寻找新的药物活性成分，我们提取分离了药用真菌阿里红的化学成分并优化了其提取工艺。进行药物活性成分的提取工艺的研究，得到一个较先进的提取工艺是研究新剂型的必需的前提，成分的最终提取率直接影响到药物的质量和疗效。提取工艺的优劣能直接影响生药的利用率以及后期加工的难易，因此，提取工艺的研究是中药生产实现现代化的关键环节，所以，中药提取工艺的研究及优化是必需的，不可或缺的。

用超声波法提取中药有效成分是近年来发展起来的一种新方法。当声波的频率超过20 kHz时，就叫做超声波。采用超声波的方法提取目标产物时，可以使整个提取过程更快速，而且常温下就能提取，整个提取过程能耗低且可以达到较高的提取率。超声波提取一般作为辅助提取方式提取目标产物，当其应用于中药有效成分的提取时，具有机械搅拌、空化效应、强化扩散、热效应、凝聚作用、乳化作用等[4]。与常规的提取方法比较，超声波法提取效果好、对有效成分破坏少，因为超声波能增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，提高药物成分溶出速度和溶出数量[5]。提取温度的高低、提取溶剂不同、提取时间的长短等等因素,都可以影响到药物有效成分的最终提取率，要想得到最佳的提取工艺必然需要进行大量的试验研究，响应曲面法是优化提取工艺时常采用的方法。

本研究在单因素试验的基础上，采用响应曲面法优化阿里红中总三萜酸成分的超声提取工艺条件。实验数据显示，超声波辅助提取阿里红中总三萜酸的最佳工艺条件为：超声功率245.2 W、提取时间34.3 min、提取温度50.0 ℃，阿里红总三萜酸得率的预测响应值为14.89%。最后验证阿里红总三萜酸的得率的理论预测值，采取超声提取的最优条件，得到阿里红总三萜酸的实际得率是14.88%，和理论预测值大致相等。试验数据说明，应用Box-benhnken设计试验优化超声波辅助提取阿里红总三萜酸的工艺，省时省力，科学性强，而且有很强实际应用价值。

参考文献：

[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准:维吾尔药分册[M].北京:科技卫生出版社，1999.

[2] 辛 国，王恩鹏，张 辉.三萜类化合物的提取分离及测定方法研究[J].长春中医药大学学报，2008,24(4)：378-380.

[3] 干伟伟，常继东.灵芝多糖提取条件的响应曲面法优化研究[J].江苏农业科学，2009(1)：259-262.

[4] 周 斌.用超声波提取中药材[J].安徽科技，2005，13(4)：23-25.

[5] 张振凌，冀春茹，李 军,等.超声提取对当归流浸膏中化学成分的影响[J].中成药，2003，19(2)：1-3.