大豆异黄酮对球囊损伤血管内膜增生的影响

牟德堂 邱仁峰

大豆异黄酮对球囊损伤血管内膜增生的影响

牟德堂①邱仁峰①

目的：探讨大豆异黄酮对球囊损伤模型兔颈动脉后再狭窄的预防。方法：建立兔右颈动脉球囊损伤模型，实验分单纯球囊损伤组（Inj）、去势后球囊损伤组（Ovx+Inj）、去势球囊损伤后补充雌激素组（Ovx+Inj+E2）、去势球囊损伤后补充大豆异黄酮组（Ovx+Inj+Iso），于28 d行彩超检查，监测损伤动脉内-中膜的厚度及内膜的光滑程度，后分组等数分别处死动物，分别计算损伤血管腔内膜/中膜面积比值。结果：Inj组与Ovx+Inj组内膜、中膜增厚明显，管腔狭窄明显，Ovx+Inj+E2组和Ovx+Inj+Iso组各时段血管形态学分析显示内膜增生程度低于Inj组与Ovx+Inj组（P<0.05）。结论：大豆异黄酮可明显抑制损伤血管内膜增生及中膜平滑肌细胞增殖，发挥其血管保护作用。

大豆异黄酮； 内膜增生； 雌激素； 雌激素受体

经皮腔内血管成形术（PTCA）是治疗冠心病的主要手段之一，近年来广泛应用于临床，该手术即刻有效率高达90%以上，但术后3～6个月再狭窄的发生率为30%～50%[1]，严重影响了该治疗方法的远期效果。研究表明，血管损伤后再狭窄是局部血管的一种修复反应，涉及复杂病理生理过程，其中最主要机制为血管本身扩张后的弹性回缩、内膜增生和中膜平滑肌细胞增值迁移引起的血管重构，今年越来越多研究表明，绝经前女性心血管发生率远远低于绝经后的发病率[2]，绝经后女性心梗后服用雌激素（E2）心衰发生率明显减低，这些研究说明雌二醇（E2）对心血管系统具有保护作用[3]，但长时间大量补充雌激素，易引发乳腺癌、子宫内膜癌及子宫出血等副作用[4]，大豆异黄酮经研究表明具备弱雌激素样作用，广泛存在于日常食物中，被称为植物雌激素（phytoestrogen，PE）[5]。去势大白兔为本实验对象，模拟动脉球囊扩张损伤，观察大豆异黄酮对去势大白兔血管损伤内膜增生的影响。

1 资料与方法

1.1 实验动物和材料 正常成年雌性新西兰大白兔48只（潍坊医学院动物实验中心），体重约2～2.2 kg；尼尔雌醇（上海医药集团有限公司华联制药厂）；大豆异黄酮40%（陕西中鑫生物技术公司）；2.5F导管球囊（强生公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组 取成年雌性新西兰大白兔48只，随机分为4组，每组12只。单纯球囊损伤组（Inj）；去势后球囊损伤组（Ovx+Inj）：去卵巢后2周实施有颈总动脉球囊扩张术；去势球囊损伤后补充雌激素组（Ovx+Inj+E2）：去卵巢后2周实施右颈总动脉球囊扩张术，给予尼尔雌醇溶液5 mg/Kg灌胃，1次/d；去势球囊损伤后补充大豆异黄酮组（Ovx+Inj+Iso）：去卵巢后两周实施右颈总动脉球囊扩张术，术后给予大豆异黄酮120 mg/kg灌胃，1次/d。

1.2.2 动物模型的建立 去卵巢术：用质量分数1%异戊巴比妥（5 mL/kg）自耳缘静脉注射麻醉大白兔，去毛、消毒皮肤，取腹正中切口，开腹后子宫末端可见到卵巢，呈桑葚样，切除双侧卵巢，结扎断端，关腹，肌注青霉素预防术后感染。

右颈总动脉球囊扩张术：兔去势后2周，麻醉方法同上，消毒，无菌下，分离右侧颈总动脉、颈外、内动脉，耳缘静脉注射肝素（1 mg/kg），颈外动脉于远心端结扎，夹闭颈总动脉近端，切开颈外静脉，向近心端插入2.5F球囊导管约3 cm，用压力泵注入等渗盐水向球囊内，压力维持在12 kPa，外拉球囊，反复3次，拔除导管，颈外动脉结扎，缝合，青霉素后抗感染（肌肉注射20万单位/只），连用3 d，1次/d。所有动物正常饮食、饮水[6]。Ovx+Inj+E2组：术后给予尼尔雌醇溶液5 mg/kg灌胃，1次/d；Ovx+Inj+Iso组：术后给予大豆异黄酮120 mg/kg灌胃，1次/d。球囊损伤后28 d先行颈动脉彩超检查，后用空气栓塞法分组等数处死模型兔，右颈总动脉留作标本，甲醛（浓度10%）固定、制作切片、HE染色，观察血管内膜、中膜。

1.2.3 采用GE LOGIQ 9彩色多普勒超声诊断仪，探头频率10 MHz。球囊损伤后第28天彩超监测损伤侧兔颈动脉内-中膜的变化。方法：兔颈部备皮后涂耦合剂，采取适宜体位固定后，检测损伤处颈动脉内-中膜的厚度、内膜的光滑程度及是否有动脉狭窄，并与健侧颈动脉进行比较。

1.2.4 HE染色切片计算动脉内膜、中膜面积和内膜/中膜面积比值 球囊损伤后第28天空气栓塞处死动物，取右颈总动脉标本，10%甲醛固定，石蜡切片，HE染色，通过光学显微镜和计算机病理图像分析系统（leica Qwin，德国）测定损伤动脉内膜、中膜面积和内膜/中膜面积比值。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验比较两组均数，单方向方差分析（One-Way AVOVA）比较多组均数。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 彩超检测兔颈动脉 右颈总动脉球囊扩张术后彩超可见内中-膜厚度较健侧增厚，内膜毛糙，动脉狭窄时可见血流束变窄，颜色明亮，且程度Ovx+Inj组和Inj组随着时间的延长也愈明显；而Ovx+Inj+Iso组内中-膜增厚程度及内膜的光滑程度与Ovx+Inj+E2组无明显差异（P>0.05），但与Ovx+Inj组和Inj组比较有明显差异（P<0.05）。统计数据见表1。

表1 各组28 d后中膜厚度（±s）

表1 各组28 d后中膜厚度（±s）

*与Inj组和Ovx+Inj组对比，P<0.01

组别 平均厚度（mm）Inj组（n=12） 0.36±0.04 Ovx+Inj组（n=12） 0.35±0.04 Ovx+Inj+E2组（n=12） 0.28±0.03*Ovx+Inj+Iso组（n=12） 0.28±0.03*

2.2 组织形态学分析 （10×20）显微镜下观察，正常动脉管壁仅有一层紧贴完整内弹力板的内侧细胞，中膜见核呈梭形平滑肌细胞。损伤后的内膜呈不均一增厚，厚度不均，内膜层可见平滑肌细胞及细胞外基质，内弹力板破坏、断裂，且有平滑肌连接断裂处，见中膜损伤并增厚，外膜变厚。Ovx+Inj+Iso组内膜增生程度（I/M ratio）与Ovx+Inj+E2组（I/M ratio）无明显差异（P>0.05），但与Ovx+Inj组（I/M ratio）和Inj组（I/M ratio）有明显差异（P<0.05）。HE染色图片见图1，统计数据见表2。

图1 28 d后血管HE染色切片

3 讨论

正常状态下，血管内皮细胞是血液与动脉壁细胞的机械屏障，防止血液中损伤因素直接作用于中层平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC），同时内皮细胞释放多种生长抑制因子，使 VSMC处于静止状态，对VSMC增殖起抑制，内皮细胞损伤后，破坏内皮细胞和VSMC平衡，内皮细胞和VSMC释放活性物质，导致VSMC迁移、增殖，新生内膜形成，内皮细胞结构和功能的破坏及VSMC迁移增殖是动脉粥样硬化及高血压和PTCA术后损伤血管内膜后引起再狭窄的重要因素。球囊损伤术后再狭窄的发生，在早期表现为血管内皮损伤后血小板黏附聚集，血栓形成；晚期表现为血管平滑肌细胞增殖和迁移而发生内膜增生导致血管重塑。大量研究发现雌激素有显著改善血管内皮功能的作用[7]，绝经后妇女的雌激素治疗可改善血脂代谢，显著降低了冠心病的发生[8]，Bakir等[9]发现雌激素可加快血管内皮修复，主要通过调节内皮细胞增殖引起，从而起到保护血管作用，植物雌激素存在于日常食物中的非甾体类化合物，日常摄入不会引起临床可见的副作用，研究表明它具有动物雌激素相似结构，具有弱雌激素样作用，因此，有望成为动物雌激素的替代品，为人们所关注。周轶琳等[4]研究证实大豆异黄酮具有雌激素样作用，增加去势化大鼠的骨密度，可有效防止去势化大鼠的骨量丢失，未见对子宫有明显的增生作用，但雌激素可促进子宫增生明显，对子宫具有显著刺激作用[3]。本实验研究发现大豆异黄酮能显著抑制兔颈动脉球囊损伤后内膜增生和中膜平滑肌的增殖。

表2 各组28 d后内膜/中膜厚度比

Vargas等在做研究时将不同浓度的含有氚标记物的雌二醇的培养液灌注猪冠状动脉前降支（CAD），发现在猪CAD外、中、内膜细胞的核内和胞浆有标记物的存在，此实验证明雌激素可直接与血管细胞作用。雌激素与其特异性受体结合调节一系列的基因表达，实现生理作用。ERα和ERβ不同的基因编码，具有不同的蛋白质和cDNA分子结构，因而发挥不尽相同的作用[10]。ERα基因远大于ERβ基因，为不同长度内含子所致，ERα基因位于6q25.1区，由140 kb碱基构成，编码蛋白分子量为66 kDa，由595个氨基酸组成，ERβ由40Kb碱基构成，位于14q22.24区，编码的蛋白质分子量为54.3 kDa，由485个氨基酸组成的。编码ERα和ERβ的基因均含有8个外显子，编码ERα和ERβ的基因均含有8个外显子，含有转录激活区AF1、2区、DNA结合域、铰链区、配体结合域[11]。

两种雌激素受体的氨基酸序列在DNA结合域和配体结合域的同源性分别达为96%和53%[12]，但是这两种雌激素受体结合的配体并不完全相同。研究显示ERα和ERβ结合经典的雌激素反应元件。在血管平滑肌细胞的胞浆和胞核可观察到表达雌激素受体免疫反应阳性，以核及核周区域表达最明显。证实血管平滑肌细胞与内膜细胞的细胞核存在雌激素受体[13-14]，只有少数雌二醇受体存在于胞浆中，血管平滑肌细胞中的雌激素受体具有雌激素依赖性基因激活功能[15]，如何有效防治PTCA术后再狭窄是目前医学界一大难题，本动物实验证明大豆异黄酮对抑制动脉内膜增生有明显效果，为临床实施雌激素替代治疗提供客观依据。

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The People’s Hospital of Shouguang， Shouguang 262700，China

Effect of Isoflavone on Balloon Catheter-Induced Neointimal Hyperplasia in Rabbit Carotid Artery

MOU De-tang，QIU Ren-feng.

Objective：To investigate the effects of phytoestrogen isoflavone on balloon catheter-induced hyperplasia of carotid artery.Method：Forty-eight female New Zealand rabbits were randomly divided into four groups：control （balloon-induced carotid artery injury only）； ovariectomy control （ovariectomy and carotid artery injury），oestrogen （ovariectomy， carotid artery injury and nilestriol， 5 mg/kg daily for 28 days）， and isoflavone （ovariectomy，carotid artery injury and isoflavone 120 mg/kg daily for 28 days）. The arterial wall thickness was assessed by coloured ultrasonography.Rusult：The medial layer thickness in the isoflavone group was less than in the ovariectomy control group（0.28±0.03 vs.0.35±0.04 mm，P<0.01）， and the intimal/medial layer （I/M） ratio was the isoflavone group was also less than in the ovariectomy control group （16.85±3.79 vs.48.94±8.92，P<0.01）.There was no statistically significant difference in the medial layer thickness or I/M ratio between the isoflavone and the oestrogen groups. Conclusion：Soybean isoflavones can play a role of protecting blood vessels to inhibit neointimal hyperplasia and the proliferation of vascular smooth muscle cell in Vascular injury .

Soy isoflavones； Endometrial hyperplasia； Estrogen； Estrogen receptors

//Medical Innovation of China，2015，12（02）：004-007

①山东省寿光市人民医院 山东 寿光 262700

邱仁峰

10.3969/j.issn.1674-4985.2015.02.002

2014-08-06） （本文编辑：陈丹云）