大鼠BMSCs向心肌样细胞分化过程中miR-128对Nkx2-5基因的调控作用

朱国伟，鞠延玲，高振宇(锦州市中心医院，辽宁锦州121001)

大鼠BMSCs向心肌样细胞分化过程中miR-128对Nkx2-5基因的调控作用

朱国伟，鞠延玲，高振宇
(锦州市中心医院，辽宁锦州121001)

摘要:目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向心肌样细胞分化过程中miR-128对Nkx2-5基因的调控作用。方法分离培养大鼠BMSCs，应用5-氮杂胞苷将其诱导为心肌样细胞，采用Real-time PCR法检测诱导6、10、14、18、22d时miR-128、Nkx2-5基因的表达。用生物信息学方法对miR-128和Nkx2-5基因的靶向匹配关系进行预测，显示miR-128与Nkx2-5mRNA的3'UTR结合情况良好。提取心肌细胞总RNA，扩增Nkx2-5mRNA 3'UTR片段，构建Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO荧光素酶报告载体，双荧光素酶检测转染Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO以及miR-128模拟物或对照miRNA的荧光强度，鉴定miR-128与Nkx2-5的靶向关系。结果将诱导6d的Nkx2-5和miR-128的表达量分别设为1，诱导10d的Nkx2-5表达量为4.33±1.32、22d为14.78±6.05，诱导10d的miR-128表达量为0.776 2±0.054 3、22d为0.197 6±0.083 6。miR-128与Nkx2-5的表达呈负相关(r =－0.546，P =0.021)。相对于转染对照miRNA(设定其荧光素酶活性为1)，转染miR-128能使Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO的荧光素酶表达下降为0.435 4±0.072 6。结论miR-128通过结合Nkx2-5mRNA 3'UTR抑制其表达，具有负性调控BMSCs向心肌样细胞分化过程中Nkx2-5表达的作用。

关键词:微小核糖核酸; Nkx2-5基因;骨髓间充质干细胞;心肌样细胞;大鼠

Regulatory effect ofmiR-128 on Nkx2-5 geneduring the process of rat BMSCsdifferentiating into cardiomyocyte-like cells

ZHU Guo-wei，JU Yan-ling，GAO Zhen-yu
(Jinzhou Central Hospital，Jinzhou 121001，China)

Abstract:Objective To investigate the regulatory effect ofmiR-128 on Nkx2-5 geneduring the process of rat bonemarrowmesenchymal stem cells(BMSCs)differentiating into cardiomyocyte-like cells.Methods BMSCs were isolated from bonemarrow and induced into cardiomyocyte-like cells using 5-azacytidine.The expression ofmiR-128 and Nkx2-5 wasdetermined by real-time PCR for the induction of 6，10，14，18 and 22days.Thematching relationships ofmiR-128 and Nkx2-5 gene were predicted by using bioinformaticsmethod which showed thatmiR-128 was well combined with 3'-untranslated region(3'UTR)of Nkx2-5mRNA.The total RNA of themyocardial cells was extracted.We amplified Nkx2-5mRNA 3 'UTR segment and constructed Nkx2-5 3' UTR-pmirGLO luciferase reporter plasmid.Luciferase activities of Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO，miR-128mimics or the controlmiRNA weredetected by using thedual-luciferase assay system.The targeted relationships ofmiR-128 and Nkx2-5 were identified.Results If the expression ofmiR-128 and Nkx2-5 on the sixthday was arbitrarilydefined as 1，the expression of Nkx2-5mRNA on the tenthday was 4.33±1.32 and increased to 14.78±6.05 on the twenty-secondday.The expression ofmiR-128 on the tenthday was 0.776 2±0.054 3 anddecreased to 0.197 6±0.083 6 on the twenty-secondday.The expression ofmiR-128 was negatively correlated with Nkx2-5(r =－0.546，P = 0.021).ThemiR-128decreased the luciferase expression of Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO to 0.435 4± 0.072 6as compared with that of the controlmiRNA(which wasdifined as 1).Conclusion ThemiR-128may inhibit the Nkx2-5 expression by combing with Nkx2-5mRNA 3'UTR，which negatively regulates the expression of Nkx2-5during the process of BMSCsdifferentiating into cardiomyocyte-like cells.

Key words:microRNA; Nkx2-5 gene; bonemarrowmesenchymal stem cells; cardiomyocyte-like cells;rats

Nkx2-5基因是心肌细胞发育过程中早期表达的转录因子，于心肌细胞分化前已有表达，开始见于心肌前体细胞并于心肌细胞分化阶段持续表达，在胚胎和成体心肌细胞中稳定表达，是调控心肌细胞分化的重要转录因子［1～3］。微小RNA(miRNA)是一类小的内源性非编码RNA，广泛参与基因表达的调控，但miRNA参与心肌样细胞的诱导分化的报道少见。2014年3月，我们应用5-氮杂胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化为心肌样细胞，检测分化过程中miR-128和Nkx2-5的表达，探讨miR-128对Nkx2-5基因表达的调控作用。

1　材料与方法

1.1材料4～6周龄SD大鼠，购于中国医科大学实验动物部，体质量80～120 g。LG-DMEM培养基、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶购于Hyclone公司，5-氮杂胞苷购自Sigma公司，兔抗大鼠多克隆cTnI和Nkx2-5抗体购自Santa Cruz公司，小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3细胞系购于中国医学科学院基础医学研究所。

1.2心肌样细胞的诱导将大鼠脱颈处死，取出股骨和胫骨，反复冲出骨髓，接种到25 cm2培养瓶内; 于37℃、5% CO2培养箱中培养，每3～4d换液1次，待细胞达到80%融合后，用0.25%胰酶消化，收集细胞传代。取第3代细胞做诱导，培养基中加入10 μmol/L的5-氮杂胞苷培养24 h后，更换完全培养基培养3周;倒置显微镜下观察，显示BMSCs均匀分布，呈梭形，诱导后细胞变细长，形态规则，平行排列。采用免疫荧光法检测cTnI和Nkx2-5蛋白的表达，光镜下显示细胞内cTnI呈绿色荧光，Nkx2-5蛋白呈红色荧光，二者均呈高表达。提示BMSCs向心肌样细胞转化。

1.3miR-128、Nkx2-5表达检测采用Real-time PCR方法。取诱导6、10、14、18、22d的细胞，分别加入RNAiso for small RNA(TaKaRa)和RNAiso Plus提取总miRNA和总RNA;用RNase-free水稀释为1 μg/μL，按照TaKaRa反转录试剂盒说明进行反转录;得到的cDNA样品稀释4倍，加入SYBRPremix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa)和miR-122检测引物或Nkx2-5检测引物;以U6或GAPDH为内参基因，在实时定量PCR仪上进行40个循环的PCR反应，应用软件对反应结果进行定量分析。

1.4miR-128与Nkx2-5的靶向关系预测采用靶基因预测软件miRanda(http: / /www.microrna.org/)和TargetScan(http: / /www.targetscan.org/)对miR-128和Nkx2-5基因(NM_053651)的靶向匹配关系进行预测，结果表明miR-128与Nkx2-5mRNA的3' UTR结合情况良好。

1.5miR-128与Nkx2-5的靶向关系鉴定

1.5.1 Nkx2-5 3'UTR的克隆取诱导培养22d的心肌样细胞，加入RNAiso Plus提取总RNA;反转录为cDNA，利用正向引物5'-CCGAGCTCCCAGGAGAAGGGCGAGA-3'和反向引物5'-GCTCTAGAGGTCCTGTTGGGTCCGT-3'扩增Nkx2-5mRNA 3'UTR片段;琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，克隆到pMD 18-T(TaKaRa)载体上测序。

1.5.2Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO的构建分别用SacⅠ和XbaⅠ双酶切pmirGLO质粒载体以及Nkx2-5 3'UTR，参照TaKaRadNA连接试剂盒说明书，将Nkx2-5 3'UTR酶切片段与pmirGLO载体酶切片段相连;构建Nkx2-5 3'UTR-pmirGLO荧光素酶报告载体，转化入DH5α感受态细胞中克隆扩增;按照AxyPrep质粒DNA小量试剂盒(Axygen)说明书从菌液中提取重组质粒，测序鉴定。

1.5.3双荧光素酶检测取NIH3T3细胞，加入含10% FBS的DMEM培养基中。转染前1d，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日融合为90%～95%。对于每孔细胞，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染Nkx2-5 3' UTR-pmirGLO 200 ng以及miR-128模拟物或对照miRNA 30 nmol/L;转染24 h后，按照Promega公司Dual-Luciferase报告基因检测系统检测两组荧光强度。

1.6统计学方法应用SPSS13.0统计软件。结果以珋x±s表示，比较采用t检验;相关性分析采用Pearson直线相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1miR-128、Nkx2-5表达将诱导6d的Nkx2-5 和miR-128的表达量分别设为1，诱导10d的Nkx2-5表达量为4.33±1.32、22d为14.78±6.05，诱导10d的miR-128表达量为0.776 2±0.054 3、22d 为0.197 6±0.083 6。相关性分析显示，二者呈负相关(r =－0.546，P =0.021)。

2.2miR-128对Nkx2-5表达的调控作用双荧光素酶检测结果显示，相对于对照miRNA(设定其荧光素酶活性为1)，miR-128能使Nkx2-5 3' UTR-pmirGLO的荧光素酶表达下降为0.435 4± 0.072 6。

3　讨论

NK-2基因主要编码转录激活因子，能够结合目的基因启动子的共有序列［T(C/T)AAGTG］，从而激活转录。Nkx2-5基因是NK型同源盒基因家族成

员之一，其蛋白产物为心肌前体细胞早期标志物，在心肌细胞分化前就已经表达，于分化过程中高表达，是心肌细胞分化过程中的重要转录因子［4～6］。Lyons等［7］研究发现，敲除Nkx2-5基因的小鼠心脏发育出现异常。Schott等［8］发现，先天性心脏病患者中Nkx2-5基因发生突变，其类型主要是无义突变、RNA剪接信号突变以及阅读框架异位突变等。虽然发育阶段的脾、胃和甲状腺组织有少量Nkx2-5蛋白表达，但出生后其表达水平显著降低，而心肌中有显著的特异性表达。表明Nkx2-5蛋白对多种器官发育有影响，但主要以对心肌的发育和分化作用为主［9］。本研究应用5-氮杂胞苷将大鼠BMSCs诱导为心肌样细胞，免疫荧光化学检测发现诱导后细胞内有cTnI和Nkx2-5蛋白表达。

miRNA广泛参与生命活动过程中的基因表达调控［10～13］，其中miR-128参与了细胞分化以及癌症发生等过程中基因表达的调控。Shi等［14］研究发现，miR-128能够靶向作用于成肌细胞分化过程中的重要转录因子肌生成抑制蛋白，过表达miR-128能够抑制小鼠成肌细胞系C2C12的增殖，却促进其分化为肌细胞。Huang等［15］应用Real-time PCR检测肝细胞癌组织中miR-128的表达，发现其较癌旁正常组织显著降低，进一步在肝癌细胞系中发现miR-128能够靶向调控PI3KR1的表达，激活PI3K/ AKT信号转导通路，抑制癌细胞的增殖，推测其或可作为诊断肝细胞癌的标志物。

本次研究运用靶基因预测软件miRanda和TargetScan对miR-128和Nkx2-5基因的靶向匹配关系进行预测，发现二者匹配关系良好。随后通过双荧光素酶报告系统研究发现，miR-128能够靶向作用于Nkx2-5 3'UTR并抑制其表达。Real-time PCR结果表明随着诱导时间延长，miR-128表达量逐渐降低，与Nkx2-5表达量呈负相关，提示miR-128参与了心肌样细胞的诱导分化过程。

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收稿日期:( 2015-05-11)

作者简介:第一朱国伟(1971-)，男，副主任医师。研究方向为心脏的介入治疗。E-mail: suifeng800sd@163.com

文章编号:1002-266X(2015)34-0001-03

文献标志码:A

中图分类号:R33

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.001