1-磷酸鞘氨醇对人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响及机制

苑永辉，戚勋，杨芳(辽宁省肿瘤医院，沈阳0004;中国医科大学附属第一医院;山东省地方病防治研究所)

1-磷酸鞘氨醇对人脐静脉血管内皮细胞增殖和迁移的影响及机制

苑永辉1，戚勋2，杨芳3
(1辽宁省肿瘤医院，沈阳110004;2中国医科大学附属第一医院;3山东省地方病防治研究所)

摘要:目的观察1-磷酸鞘氨醇(S1P)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移的影响，探讨其作用机制。方法将HUVEC分为A～F组，A组只加细胞培养液，B～F组分别加入10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol/L的S1P;采用CCK-8法检测各组培养48 h的OD450值，Transwell实验计数各组穿膜细胞数。将HUVEC分为3组，空白对照组加细胞培养液，低浓度组和高浓度组分别加10－7、10－6mol/L的S1P;采用Western blot法检测ERK、p-ERK蛋白，计算二者比值。结果A～F组OD450值分别为0.50±0.03、0.51±0.06、0.65±0.04、0.82±0.19、0.99± 0.06、0.99±0.02，穿膜细胞数分别为(66.59±9.11)、(76.72±4.80)、(83.75±7.59)、(101.39±5.03)、(101.50 ±8.96)、(99.38±13.03)个/HP。D、E、F组与A组比较，P均＜0.05; B、C组与A组比较，P均＞0.05;d、E、F组间比较，P均＞0.05。空白对照组、低浓度组和高浓度组p-ERK蛋白与ERK蛋白比值分别为0.39±0.03、0.94± 0.07、0.97±0.05，低浓度组和高浓度组与空白对照组比较，P均＜0.01。结论S1P可通过MAPK/ERK通路促进HUVEC的增殖和迁移。

关键词:1-磷酸鞘氨醇;内皮细胞;细胞增殖;细胞迁移;mAPK/ERK通路

Effect of sphingosine-1-phosphate onmigration and proliferation of HUVECs and itsmechanism

YUAN Yong-hui1，QI Xun，YANG Fang
(1 Liaoning Cancer Hospital＆Institute，Shenyang 110004，China)

Abstract:Objective To observe the effect of sphingosine-1-phosphate(S1P)onmigration and proliferation of human umbilicus vein endothelial cells(HUVECs)and to investigate itsmechanism.Methods HUVECs weredivided into，group A to group F，group A was only added with cell culturemedium，group B to group F were added withdifferentconcentrations of S1P(10－10，10－9，10－8，10－7and 10－6mol/L，respectively).CCK-8method was used todetect the OD450value 48 h after treatment，Transwell cellmigration assay was employed to investigate the number ofmigrated cells.HUVECs weredivided into three groups: the blank control group which was only added with cell culturemedium，low-dose group and high-dose group were added with 10－7and 10－6mol/L S1P; the protein expression levels of phospho-ERK and ERK weredetected by Western blotting，then the ratio of pERK to ERK was calculated.Results The OD450values of group A to group F were 0.50±0.03，0.51±0.06，0.65±0.04，0.82±0.19，0.99±0.06 and 0.99±0.02，and the numbers ofmigrated cells were(66.59±9.11)，(76.72±4.80)，(83.75±7.59)，(101.39±5.03)，(101.50± 8.96)and(99.38±13.03)/ HP.Significantdifference was found between group A and groupsd，E，F(allP＜0.05); nodifference was found between group A and groups B，C(all P＞0.05)，and nodifference was found between groupsd，E and F(all P＞0.05).The ratios of pERK to ERK in the blank control group，low-dose and high-dose groups were 0.39±0.03，0.94±0.07 and 0.97±0.05，and significantdifference was found between the blank control group and low-dose group，high-dose group(all P＜0.01).ConclusionS1P can promote themigration and proliferation ofHUVECs throughmAPK/ERK signaling pathway.

Key words:sphingosine-1-phosphate; endothelial cells; cell proliferation; cellmigration;mAPK/ERK signaling pathway

治疗性血管新生是下肢缺血性疾病、缺血性心脏病等局部缺血性疾病的重要治疗方法［1，2］，是将外源性血管新生诱导因子转入组织中，增强缺血区的侧支毛细血管新生，从而加速侧支循环的形成［3］。这一过程与血管内皮细胞(VEC)迁移和增殖密切相关［4］。1-磷酸鞘氨醇(S1P)是一种具有重要生物学活性的溶血磷脂，可作用于5种G蛋白偶联S1P受体(S1P1、S1P2、S1P3、S1P4和S1P5)［5］。目前尚未见S1P对VEC增殖和迁移作用的相关报道。2015年3～6月，我们检测了S1P对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖和迁移的影响，并探讨MAPK/ERK在其中发挥的作用。现报告如下。

1　材料与方法

1.1主要试剂S1P购自Enzo Life Sciences公司，HUVEC细胞株购于凯基生物;牛血清白蛋白(BSA)、PBS及RPMI1640培养基均购自Sigma-Aldrich公司，胎牛血清、青—链霉素和胰蛋白酶购自于Life Technology公司，结晶紫购自于国药试剂;细胞增殖—毒性检测试剂盒购自Dojindo公司，Transwell小室购自于Millipore公司，ERK多克隆抗体及phoshpo-ERK单克隆抗体购自于Cell Signaling Technology公司。

1.2细胞培养将HUVEC解冻复苏后加入含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养基，置于37℃、5% CO2培养箱内培养，待细胞融合至80%～90%状态进行实验。1.3HUVEC增殖能力观察采用CCK-8法。HUVEC细胞经PBS清洗、胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，按2×103/孔接种于96孔板。正常培养24 h后弃培养液，换含有0.5% BSA的培养液预处理24 h，以达到细胞同步化。将细胞分为A～F组6组，A组只加细胞培养液，B～F组分别加入10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol/L的S1P 100 μL/孔;每组设5个复孔，继续常规培养48 h;每孔加入CCK-8溶液10 μL，细胞培养箱内孵育4 h后，使用酶标仪测450 nm处的OD值，OD450值越大表示细胞增殖能力越强。

1.4 HUVEC迁移能力观察采用Transwell实验。取对数生长期HUVEC细胞，用含0.5% BSA的RPMI1640培养基血清饥饿24 h;经PBS清洗、胰蛋白酶消化制成含0.25% BSA的RPMI1640细胞悬液(5×105/mL)，上室加细胞200 μL。将细胞分为A～F组6组，A组下室只加细胞培养液500 μL，B～F组分别加入10－10、10－9、10－8、10－7、10－6mol/L 的S1P 500 μL，置于37℃、5% CO2培养箱中培养4.5 h;取出Transwell小室，用棉签拭去上室面的残余细胞，甲醛固定，结晶紫染色;风干后于显微镜下观察细胞，取上、下、左、右、中间5个视野计数穿膜细胞数。实验重复4次，取平均值。

1.5 HUVEC中p-ERK及ERK蛋白表达检测采用Western blot法。取对数生长期HUVEC，按3× 105/孔接种于6孔板，待90%融合后分为3组。空白对照组加细胞培养液2.5mL，低浓度组和高浓度组分别加10－7、10－6mol/L的S1P 2.5mL; 4 h后加入100 μL裂解液中冰上裂解5min，收集蛋白于离心管后超声破碎，继续4℃冰上裂解40min。4℃离心15min，取上清液;用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，蛋白样本99℃高温水浴变性。取50 μg蛋白样品，用10%的SDS-PAGE分离蛋白，通过电泳将蛋白印迹转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭。加入ERK多克隆抗体及p-ERK单克隆抗体，4℃孵育过夜，BCIP/NBT显色。计算p-ERK与ERK蛋白比值。

1.6统计学方法采用GraphPad Prism6.0统计软件。数据以珋x±s表示，比较采用单向方差分析。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1 S1P对HUVEC增殖能力的影响A～F组OD450值分别为0.50±0.03、0.51±0.06、0.65± 0.04、0.82±0.19、0.99±0.06、0.99±0.02。D、E、F组与A组比较，P均＜0.05; B、C组与A组比较，P均＞0.05;d、E、F组间比较，P均＞0.05。

2.2 S1P对HUVEC迁移能力的影响A～F组穿膜细胞数分别为(66.59±9.11)、(76.72±4.80)、(83.75±7.59)、(101.39±5.03)、(101.50± 8.96)、(99.38±13.03)个/HP。D、E、F组与A组比较，P均＜0.05; B、C组与A组比较，P均＞0.05;d、E、F组间比较，P均＞0.05。

2.3 S1P对HUVEC中p-ERK与ERK蛋白表达的影响空白对照组、低浓度组和高浓度组p-ERK蛋白与ERK蛋白比值分别为0.39±0.03、0.94± 0.07、0.97±0.05，低浓度组和高浓度组与空白对照组比较，P均＜0.01。

3　讨论

在生理条件下，完整的单层VEC系统是血管壁发挥正常功能的必要条件。而在许多血管病变的病理过程中，包括动脉粥样硬化和血管再狭窄等，由于血管损伤导致内皮功能的丧失和失去完整性。因此，促进和恢复VEC完整性的研究极为重要。血管新生是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展

而形成新的血管，主要包括血管基底膜降解，VEC的激活、增殖、迁移，重建形成新的血管和血管网三大步骤，是一个涉及多种细胞和多种分子的复杂过程［6］。血管新生在生长或发育上扮演重要角色，例如伤口愈合、女性经期、胎儿生长发育。在血管新生过程中，首要步骤是VEC在趋化因子的作用下发生迁移、增殖［7，8］。要达到治疗性血管新生的目的，血管新生诱导因子必须作用于微血管内皮细胞的特异性受体，引起微血管内皮细胞增殖、迁移，形成毛细血管样管腔结构，然后经过血管的重构形成新的毛细血管网［9，10］。

S1P是一种具有重要生物学活性的溶血磷脂，主要来源于细胞膜鞘磷脂的分解代谢。有研究表明，S1P1受体和S1P3受体通过G蛋白偶联受体Gi来上调Rac引起细胞的趋化作用，S1P2受体通过G蛋白偶联受体G12/13来激活Rho，从而下调Rac，进而抑制细胞的趋化作用［11，12］。内皮细胞大量表达S1P1和S1P3受体，而平滑肌细胞大量表达S1P2 和S1P3受体。因此，内皮细胞主要是通过G蛋白偶联受体Gi来上调Rac引起细胞的趋化作用［13］，G蛋白偶联受体可以激活MAPK/ERK信号转导途径［14］。MAPK信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应(如细胞增殖、分化、转化及凋亡等)的过程中具有至关重要的作用。MAPK/ERK是参与血管新生的重要信号转导通路［15］，但目前尚未见S1P对VEC增殖和迁移的作用及与MAPK/ERK信号转导途径相关机制的研究报道。本实验Western blot检测结果发现，与A组相比，D、E、F组p-ERK/ERK上调，提示S1P可能在ERK信号通路的激活过程中发挥作用，促进VEC血管生成，从而增加局部组织的血流灌注量，有效改善微循环功能障碍。

本研究显示，S1P能通过上调p-ERK，促进VEC增殖和迁移，由此推测S1P在缺血性疾病血管新生的发生和发展中具有一定作用，有利于缺血部位侧支循环的形成，为治疗性血管新生奠定理论基础。

参考文献:

［1］LosordodW，Dimmeler S.Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemicdisease.Part I: angiogenic cytokines［J］.Circulation，2004，109(21): 2487-2491.

［2］LosordodW，Dimmeler S.Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemicdisease: part II: cell-based therapies［J］.Circulation，2004，109(22): 2692-2697.

［3］Simonsm，Ware JA.Therapeutic angiogenesis in cardiovasculardisease［J］.Nat Revdrugdiscov，2003，2(11): 863-871.

［4］TonnesenmG，Feng X，Clark RA.Angiogenesis in wound healing ［J］.J Investigdermatol Symp Proc，2000，5(1): 40-46.

［5］Takuwa Y，Okamoto Y，Yoshioka K，et al.Sphingosine-1-phosphate signaling in physiology anddiseases［J］.Biofactors，2012，38(5): 329-337.

［6］Battegay EJ.Angiogenesis:mechanistic insights，neovasculardiseases，and therapeutic prospects［J］.Jmolmed(Berl)，1995，73(7): 333-346.

［7］Marcelo KL，Goldie LC，Hirschi KK.Regulation of endothelial celldifferentiation and specification［J］.Circ Res，2013，112(9): 1272-1287.

［8］戴国华，马培泽，宋宪波，等.缺氧对大鼠心肌微血管内皮细胞血管新生能力的影响［J］.山东医药，2014，54(18): 10-13.

［9］DeCicco-Skinner KL，Henry GH，Cataisson C，et al.Endothelial cell tube formation assay for the in vitro study of angiogenesis［J］.J Vis Exp，2014，1(91): 51312.

［10］Korn C，Augustin HG.Mechanisms of Vessel Pruning and Regression［J］.Dev Cell，2015，34(1): 5-17.

［11］Takuwa Y，Okamoto Y，Yoshioka K，et al.Sphingosine-1-phosphate signaling and biological activities in the cardiovascular system ［J］.Biochim Biophys Acta，2008，1781(9): 483-488.

［12］Arikawa K，Takuwa N，Yamaguchi H，et al.Ligand-dependent inhibition of B16melanoma cellmigration and invasion via endogenous S1P2 G protein-coupled receptor.Requirement of inhibition of cellular RAC activity［J］.J Biol Chem，2003，278(35): 32841-32851.

［13］李方方，李文庆，荆清.G蛋白偶联受体在血管发育中的作用［J］.遗传，2013，35(4): 459-467.

［14］Okamoto Y，Yoshioka K，Takuwa N，et al.Cardiovascular function of sphingosine 1-phosphate signaling［J］.Seikagaku，2011，83(6): 536-544.

［15］Thomas CJ，Lim NR，Kedikaetswe A，et al.Evidence that themEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection frommyocardial ischemia-reperfusion injury by 3'，4'-dihydroxyflavonol［J］.Eur J Pharmacol，2015(758): 53-59.

收稿日期:( 2015-07-24)

作者简介:第一苑永辉(1978-)，男，主管检验技师，博士学位，博士后在读。研究方向为感染症制御学与分子生物学。E-mail: yyxhdh@126.com

基金项目:辽宁省博士科研启动基金计划资助项目(20141183);辽宁省教育厅一般项目(L2012282)。

文章编号:1002-266X(2015)34-0011-03

文献标志码:A

中图分类号:R331

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.004