人胃癌细胞株BGC-823克隆形态观察及其CD44表达变化

杨宏琼，陆亚华，周志华，张尤历，徐岷(常州市第一人民医院，江苏常州00;江苏大学附属医院;中国人民解放军第0医院)

人胃癌细胞株BGC-823克隆形态观察及其CD44表达变化

杨宏琼1，陆亚华1，周志华2，张尤历3，徐岷3
(1常州市第一人民医院，江苏常州213003;2江苏大学附属医院;3中国人民解放军第101医院)

摘要:目的观察胃癌细胞株BGC-823的克隆形态，检测干细胞标志物CD44在不同克隆形态中的表达。方法通过克隆形成实验观察BGC-823细胞的克隆形态并分类，计算克隆形成率及每种克隆所占比例，采用免疫荧光染色和Western blot法检测不同克隆形态中CD44的表达情况。结果BGC-823细胞形成3种克隆形态，Holoclone、Meroclone和Paraclone型。克隆形成率为8.4%±1.1%，Holoclone型、Meroclone型和Paraclone型所占比例分别为9.8%、54.0%和36.2%。CD44在Holoclone型克隆中表达量最多。结论BGC-823细胞的克隆在形态和分化程度上存在差异，其中Holoclone型克隆可能富含胃癌干细胞。

关键词:胃肿瘤;肿瘤干细胞;细胞克隆; CD44

肿瘤干细胞学说认为，肿瘤中含有少量具有自我更新能力和分化潜能、并能产生耐药的肿瘤细胞，即肿瘤干细胞，是肿瘤发生、复发和转移的根源［1，2］。研究发现，在体外培养条件下，多种上皮癌细胞株存在形态不同的克隆，其中具有规则致密形态的Holoclone型克隆经证实含有肿瘤干细胞［3，4］。2014年7月～2015年12月，我们观察了胃癌细胞株BGC-823的克隆形态，并检测干细胞标志物CD44在不同克隆形态中的表达，为研究胃癌的发生、发展机制提供依据。

1　材料与方法

1.1材料胃癌细胞株BGC-823购自中科院上海细胞生物学研究所;胎牛血清(FBS，Gibco)，胰酶(Sigma公司); Triton X100(Ameresco)，牛血清白蛋白(BSA)、DAPI(Sigma公司);克隆环(PYREX公司);兔多抗CD44、β-tubulin购自英国Abcam公司，羊抗兔二抗(辣根酶标记)、羊抗兔二抗(FITC标记)购自北京中杉金桥公司; CO2恒温细胞培养箱(Sanyo公司)，倒置相差显微镜(Olympus公司)，激光共聚焦显微镜(德国徕卡公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养将细胞接种于含10% FBS的DMEM培养液中，5% CO2、37℃培养。隔天换液1次，当细胞汇合并铺满培养瓶底约80%时，进行传代培养。

1.2.2细胞克隆形态观察采用平皿克隆形成法。取对数生长期细胞，胰酶消化，制成单细胞悬液。将细胞以500个/皿接种于直径100mm的培养皿，共接种6个皿。静置培养14d，动态观察标记克隆形态并记录细胞数。第14天显微镜下判断细胞克隆形成，计算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%。弃培养基，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定，Giemsa染色。参照文献［5］将克隆分为Holoclone、Meroclone和Paraclone 3型，计算不同类型克隆的比例。

1.2.3细胞克隆CD44阳性检测采用免疫荧光染色技术。取对数生长期细胞，消化、计数后以约300 个/皿的密度均匀接种于直径为30mm的培养皿，共接种8个皿。静置培养14d，随机选择5个皿(其他3个用于Western blot实验)，弃培养基，PBS漂洗，4%多聚甲醛固定，BSA封闭。滴加一抗(CD44，1∶100)，4℃孵育过夜，PBS漂洗后滴加二抗(羊抗兔-FITC，1∶50)，37℃孵育1 h，PBS漂洗，DAPI(1∶100)染核，甘油封片，激光共聚焦显微镜观察染色结果。在DAPI核定位染色蓝色荧光强度相同的情况下，观察CD44(FITC)的绿色荧光在Holoclone、Meroclone和Paraclone中的染色强度，比较不同克隆中CD44的表达强度。

1.2.4细胞克隆CD44表达量检测采用Western blot方法。取上述培养第14天的3个培养皿，选5个Holoclone、Meroclone和Paraclone型克隆，在克隆环中消化细胞后，分别单独接种于100mm培养皿中扩大培养，隔天换液。培养第12天，弃培养液，PBS漂洗后对3种克隆进行裂解，提取总蛋白，测蛋白浓度。

Paraclone型克隆由于细胞极少，所提蛋白量不足，将其舍弃。取BGC-823胃癌细胞蛋白作为对照。将蛋白样品与6×Loading buffer按5∶1体积比混合，100℃水浴5min，离心后取上清。配制12%分离胶、5%浓缩胶，以50 μg蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳。恒流转膜，5%脱脂奶室温封闭1 h，加一抗(兔抗人CD44，1∶1 000或β-tubulin，1∶500)，4℃孵育过夜，TBS洗膜后分别加二抗(羊抗兔HRP-IgG，1∶1 000)，37℃孵育1 h，洗膜后发光、显影，以CD44与对应内参β-tubulin的灰度值之比作为各自的相对表达量。

1.2.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量数据以珋x±s表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1细胞克隆生长形态及克隆形成率细胞培养第1～2天，细胞呈单个均匀分布;第3天逐渐形成克隆;第5天发现有的克隆细胞体积大，有的则较小;第7～10天，不同克隆细胞在体积、细胞排列紧密程度及细胞数各方面区别明显;第11～14天，不同克隆区别更加明显。倒置相差显微镜下可见，Holoclone型克隆形态规则，边界平滑，细胞数目多，体积小，排列致密; Paraclone型克隆形态不规则，细胞数目少，体积大，排列松散;meroclone型克隆介于Holoclone和Paraclone型克隆之间。第14天，细胞克隆形成率为8.4%±1.1%，其中Holoclone、Meroclone和Paraclone型克隆所占比例分别为9.8%、54.0%和36.2%。

2.2细胞克隆CD44检测结果CD44在Holoclone型克隆中呈强阳性表达，在Meroclone型克隆中的表达弱于Holoclone型克隆，在Paraclone型克隆中表达最弱。CD44在Holoclone、Meroclone型克隆和BGC-823胃癌细胞中的相对表达量分别为0.578±0.102，0.096 ±0.034，0.009±0.002，Holoclone型克隆表达量最多(P均＜0.05)。

3　讨论

目前已证实，多种肿瘤中存在肿瘤干细胞，如前列腺癌［3］、胰腺癌［4］、急性白血病［5］、结肠癌［6］、神经胶质瘤［7］及乳腺癌［8］等。肿瘤干细胞可形成3种不同形态的克隆，分别称为Holoclone、Meroclone 和Paraclone，其中Holoclone型克隆形态规则、细胞排列紧密，具有肿瘤干细胞的特性。我们的前期研究［9］也有类似的结论。

本实验运用平皿克隆形态分离法，在胃癌细胞株BGC-823中发现了3种克隆形态，通过检测CD44的表达情况比较不同克隆的分化特性，结果显示CD44在Holoclone型克隆中表达最强。CD44是一种分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，属于黏附分子家族，作为细胞表面组分与细胞外间质相互作用，参与细胞的迁徙运动。CD44过表达与肿瘤的浸润、转移、分期及耐药等关系密切［10］。研究显示，CD44是头颈部鳞癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌等多种肿瘤干细胞的表面分子标记物［11］。Takaishi等［12］研究认为，CD44阳性胃癌细胞可能是胃癌干细胞。因此推测，Holoclone型克隆可能富含胃癌干细胞，为下一步体内外肿瘤干细胞的鉴定提供基础与支持，对将来临床中设计针对胃癌干细胞的靶向治疗具有重要意义。

综上所述，BGC-823细胞的克隆在形态和分化上存在差异，其中Holoclone型克隆可能富含胃癌干细胞。

参考文献:

［1］Gupta P，Chaffer CL，Weinberg RA.Cancer stem cells:mirage or reality［J］.Natmed，2009，15(9): 1010-1012.

［2］Yoon SK.The biology of cancer stem cells and its clinical implication in hepatocellular carcinoma［J］.Gut Liver，2012，6(1):29-40.

［3］Li H，Chen X，Calhoun-Davis T，et al.PC3 human prostate carcinoma cell holoclones contain self-renewing tumor-initiating cells ［J］.Cancer Res，2008，68(6): 1820-1825.

［4］Tan L，Sui X，Deng H，et al.Holoclone forming cells from pancreatic cancer cells enrich tumor initiating cells and represent a novelmodel for study of cancer stem cells［J］.PLoS One，2011，6(8): 23383.

［5］Lockem，Heywoodm，Fawell S，et al.Retention of intrinsic stem cell hierarchies in carcinoma-derived cell lines［J］.Cancer Res，2005，65(19): 8944-8950.

［6］Du L，Wang H，He L，et al.CD44is of functional importance for colorectal cancer stem cells［J］.Clin Cancer Res，2008，14(21): 6751-6760.

［7］Zhou ZH，Ping YF，Yu SC，et al.A novel approach to the identification and enrichment of cancer stem cells from a cultured human glioma cell line［J］.Cancer Lett，2009，281(1): 92-99.

［8］周志华，易良，卞修武，等.人恶性胶质瘤细胞株U251三种克隆的分化特性和胶质瘤干细胞的初步鉴定［J］.中华神经外科杂志，2008，24(9): 658-661.

［9］杨宏琼，周志华，张尤历，等.人胃癌细胞株SGC-7901的克隆形态观察及含肿瘤干细胞克隆的鉴定［J］.中华肿瘤杂志，2012，35(3): 164-169.

［10］Naord，Wallach-Dayan SB，ZahalkamA，et al.Involvement of CD44，amolecule with a thousand faces，in cancerdissemination ［J］.Semin Cancer Biol，2008，18(4): 260-267.

［11］Ailles L，Princem.Cancer stem cells in head and neck squamous cell carcinoma［J］.Methodsmol Biol，2009(568): 175-193.

［12］Takaishi S，Okumura T，Tu S，et al.Identification of gastric cancer stem cells using the cell surfacemarker CD44［J］.Stem Cells，2009，27(5): 1006-1020.

收稿日期:( 2015-01-11)

文章编号:1002-266X(2015)34-0024-02

文献标志码:A

中图分类号:R735.2

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.009