HIF-2α、ABCG2、OCT-4与胃癌化疗耐药的关系研究

张红梅，刘学杰，王婧雅，张小茜

HIF-2α、ABCG2、OCT-4与胃癌化疗耐药的关系研究

张红梅，刘学杰，王婧雅，张小茜

目的探讨HIF-2α、ABCG2、OCT-4与人胃癌化疗耐药的关系。方法2011年1月－2013年6月在我院消化科就诊的符合条件的经电子胃镜和病理证实为晚期胃癌的患者52例，均采用FOL-FOX4全身化疗，根据化疗效果的不同分为有效[包括完全缓解(CR)和部分缓解(PR)]组、稳定(SD)组、进展(PD)组。采用RT-PCR、免疫组织化学染色检测不同治疗效果肿瘤组织中HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表达。结果52例患者经过4周期FOL-FOX4方案化疗，其中CR 2例，PR 19例，SD 25例，PD 6例。即有效(CR+PR)组21例(40.4%)，稳定组25例(48.1%)，进展组6 例(11.5%)。CR+PR组中HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白呈低水平表达，SD组HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA及蛋白的表达较CR+PR组明显增加，PD组表达进一步增加，CR+PR组、SD组和PD两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-2α、ABCG2、OCT-4等肿瘤干细胞标记物的mRNA和蛋白在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤的化疗效果有关，其高水平表达或许是化疗效果差和耐药的主要原因之一。

胃肿瘤；抗肿瘤联合化疗方案；抗药性，肿瘤

对于肿瘤晚期失去手术机会或因心肺功能障碍不宜手术的患者，进行以化疗为主的综合治疗是提高患者生存率、延长寿命的关键因素。5-氟尿嘧啶(5-Fu)和奥沙利铂(oxaliplatin，L-OHP)都是抗代谢的化疗药物，是国内外肿瘤临床辅助化疗和新辅助化疗最常用的药物。但由于患者个体差异以及肿瘤本身异质性的存在，不同患者对治疗的反应和治疗效果存在差异[1]。化疗耐药的产生不仅导致治疗效果差，而且会对肿瘤患者的免疫功能产生很大损害[2]。本研究通过检测肿瘤组织中HIF-2α、ABCG2、OCT-4的表达，以期找到与化疗疗效和化疗耐药相关的标记物，帮助临床医师有针对性地选择化疗方案，避免不必要的细胞毒性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2011年1月－2013年6月在我院消化科就诊的经电子胃镜和病理证实为晚期胃癌的患者52例，包括不具备手术条件的晚期胃癌患者和虽具备手术条件，但因年龄大、心肺功能差或其他原因拒绝手术的胃癌患者。其中男29例，女23例，平均年龄59(30～81)岁。

1.2 主要试剂 5-Fu为江苏振国药业有限公司生产，L-OHP购自江苏恒瑞医药股份有限公司。HIF-2α、OCT-4、ABCG2多克隆抗体及免疫组化试剂盒均为Abcam公司产品，Trizol试剂为Invitrogen公司产品，反转录试剂盒及PCR试剂盒均购自Fermentas公司。

1.3 治疗方法 52例患者均用采用FOL-FOX4全身化疗：L-OHP 85mg/m2，静脉滴注2h，第1天；亚叶酸钙(LV)200mg/m2，静脉滴注2h，第1～2天；5-Fu 400mg/m2，快速静脉滴注0.5h，5-Fu 600mg/ m2，持续静脉滴注22h，第1～2天。每2周重复，28d为1个周期，并使用格拉司琼、胃复安等止吐治疗，共用4个周期。每周期无延时。疗程结束4周后行电子胃镜及上腹部CT检查，评价治疗效果。

1.4 治疗效果评价 肿瘤客观疗效评定参照WHO实体瘤疗效评价统一标准[3]。①完全缓解(CR)：病灶完全消失并持续4周以上；②部分缓解(PR)：病灶缩小50%以上并持续4周以上；③稳定(SD)：病灶缩小不及50%或增大不超过20%，无新病灶出现；④进展(PD)：肿瘤增大超过20%。按照治疗效果分为3组：有效组(包括CR和PR)、稳定组、进展组。

1.5 免疫组织化学法检测肿瘤组织中HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白表达水平的变化 将采集的各组标本用4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，HE染色，光镜下观察。每组肿瘤组织免疫组织化学染色按SP-9000试剂盒步骤进行，DAB显色，脱水，透明，中性树胶封固。以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判定：HIF-2α、OCT-4和ABCG2阳性结果为细胞质内出现棕黄色颗粒。采用图像分析软件检测HIF-2α、ABCG2、OCT-4阳性细胞的平均吸光度(A)值，以反映蛋白的相对表达量，并取其平均值。

1.6 RT-PCR法检测HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA在不同组织表达水平的变化 采用Trizol法提取肿瘤组织总RNA，以1ml DEPC水溶解。反转录合成cDNA第一链，反应条件：70℃ 5min，速置于冰上；37℃ 5min；37℃ 60min；70℃ 10min，置冰上进行后续试验或–20℃保存。HIF-2α上游引物序列：5'-CTTGGAGGGTTTCATTGCTGTGGT-3'，下游引物序列：5'-GTGAAGTCAAAGATGCTGTGTCC T-3'，产物长度为123bp；ABCG2上游引物序列：5'-CCCTTATGATGGTGGCTTATTC-3'，下游引物序列：5'-GTGAGATTGACCAACAGACCAT-3'，产物长度为1 3 2 b p；O CT-4上游引物序列：5'-CCCGAAAGAGAAAGCGAACC-3'，下游引物序列：5'-CAGAACCACACTCGGACCAC-3'，产物长度为151bp。GAPDH上游引物序列：5'-GCACCACCAACTGCTTAGCAC-3'，下游引物序列：5'-GCAGCGCCAGTAGAGGCAGG-3'， 产物长度为143 bp。PCR反应条件为：94℃ 5min；94℃30s， 50℃ 30s， 72℃ 60s，40个循环；72℃延伸10min。以HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNAA值与GAPDHA值的比值表示mRNA的相对表达量。

1.7 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，定量资料以表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 治疗效果 52例患者进行4个周期的FOLFOX4方案化疗，结束后4周行电子胃镜及上腹部CT检查，治疗效果如下：CR 2例，PR 19例，SD 25例，PD 6例。即有效组(CR+PR)21例(40.4%)，稳定组(SD)25例(48.1%)，进展组(PD)6例(11.5%)。

2.2 肿瘤组织中HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白的表达 HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白阳性表达呈棕黄色颗粒状，主要弥散分布于整个胞质或沿核膜周边呈线状分布，强阳性时细胞核亦可见表达。PD组人胃癌组织中HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白的表达最强，其次为SD组，CR+PR组3种蛋白的表达明显减弱，基本不表达。CR+PR组与SD组、PD组两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05，图1)。

2.3 肿瘤组织中HIF-2α、ABCG2、Oct-4 mRNA的表达 CR+PR组HIF-2α、ABCG2、Oct-4 mRNA呈低水平表达，SD组HIF-2α、ABCG2、Oct-4 mRNA的表达较CR+PR明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)，PD组的表达较SD组进一步增加，差异有统计学意义(P<0.05)。CR+PR组、SD组和PD组两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05，图2)。

图1 免疫组化法检测肿瘤组织HIF-2α、ABCG2、OCT-4蛋白的表达(×400)Fig.1 Expressions of HIF-2α, ABCG2 and OCT-4 proteins (Immunocytochemistry, ×400)

图2 RT-PCR检测肿瘤组织中HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA的表达Fig.2 Expressions of HIF-2α, ABSG2 and Oct-4 mRNA in human gastric cancer (RT-PCR)A. CR+PR group; B. SD group; C. PD group. (1)P<0.05 compared with CR+PR group; (2)P<0.05 compared with SD group

3 讨 论

进展期胃癌以综合治疗为主，化疗是其主要方法之一，但癌细胞多药耐药的产生使得化疗药物的应用受到明显限制。与顺铂和卡铂比较，L-OHP毒性显著降低，更容易与其他抗肿瘤药物联合应用，以L-OHP和5-Fu联合的FOL-FOX4方案已成为治疗进展期胃癌的首选化疗方案[4]。但由于肿瘤细胞多药耐药的存在，L-OHP在临床使用过程中也存在明显的耐药现象[5]。5-Fu是FOL-FOX4方案中另一起主要作用的药物，它通过影响细胞DNA的合成导致细胞损伤和死亡，诱导凋亡是其抗肿瘤机制之一[6]，此外5-Fu还是细胞周期特异性药物，对细胞各个周期均有抑制作用，以S期的作用最佳[7]，但患者癌细胞耐药性的存在降低了的5-Fu实际疗效。根据前期经验、相关专家意见以及小规模的临床试验结果，同时考虑到化疗疗效和毒副作用，我们对本组患者采用FOL-FOX4方案进行化疗，结果显示，采用5-Fu与L-OHP联合的FOLFOX4方案治疗晚期胃癌患者，有效率为40.4%，与国内外研究基本一致[8-10]，即仍有相当一部分患者对FOL-FOX4方案耐药。对不适合手术的晚期胃癌患者如何有选择性地应用化疗方案，避免不必要的细胞毒化疗，成为亟待解决的重要问题。

近年研究认为，肿瘤组织中存在数量很少但自我更新能力和多向增殖潜能较强的细胞即肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)，与肿瘤的产生、转移、复发及耐药有关[11-12]。但至目前，由于许多肿瘤干细胞标志物还未确定，尚无法直接分离鉴定其中的干细胞。低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)与肿瘤的血管生成、侵袭转移及放化疗抵抗等恶性生物学行为有关[13]。HIFs包括HIF-1、HIF-2和HIF-3，其中HIF-2α与CSCs的关系更密切，可通过调控多种干细胞有关通路来维持干细胞表型。ATP结合盒基因2(ATP-Binding cassette gene 2，ABCG2)是一种ABC转运蛋白，可外排多种化疗药物，在肿瘤组织中高表达，导致肿瘤对多种化疗药物不敏感[14]。研究发现，多种CSCs高表达ABCG2，后者还是HIF-2α的直接靶基因，HIF-2α-ABCG2通路高表达可导致CSCs的多药耐药[15]。OCT-4属于POU转录因子成员，是一种多能干细胞标记物，有研究认为OCT-4也与CSCs关系密切[16-17]。最近Wang等[18]报道肝细胞癌中存在一条潜在的肿瘤细胞化疗抵抗轴OCT4-AKT-ABCG2，可见CSCs 中OCT-4的高表达亦可与ABCG2协同促进肿瘤的化疗抵抗。另外，ABCG2也是HIF-2α的直接靶基因，HIF-2α-ABCG2通路高表达可导致CSCs多药耐药[19]。

目前研究显示，L-OHP的耐药机制可能与外排药物增加有关[20]：细胞膜上的膜转运蛋白可将药物“泵”出细胞外，导致细胞内药物浓度降低，从而导致耐药。ABCG2的表达升高可促进化疗药物在体内排泄，因而增加肿瘤细胞对化疗药物的耐受性。而肿瘤微环境及基因突变是5-Fu耐药的机制之一，我们前期的研究证实肿瘤低氧微环境导致HIF-2α表达升高，可诱导干细胞标记物ABCG2和OCT-4的表达[21]；OCT-4对维持干细胞的未分化状态至关重要，可使细胞处于G0期，对作用于S期的化疗药物氟尿嘧啶产生抵抗[22]。

我们前期的动物实验研究发现[23]，裸鼠胃癌移植瘤腹腔注射5-Fu后，HIF-2α、ABCG2、OCT-4 的mRNA和蛋白表达增加，表明体内外胃癌细胞对5-Fu的化疗抵抗可能与诱导肿瘤干细胞标记物HIF-2α、ABCG2、OCT-4高表达，促进肿瘤细胞的干细胞化有关。本研究结果显示，CR+PR组肿瘤组织HIF-2α、ABCG2、Oct-4 mRNA和蛋白呈低水平表达，SD组表达较CR+PR组增加，PD组表达则进一步增加，进一步提示HIF-2α、ABCG2、OCT-4等基因和蛋白的高表达是导致肿瘤化疗效果差的重要原因，也是化疗耐药的重要标记物。HIF-2α、ABCG2、OCT-4有望成为晚期胃癌患者以FOL-FOX4为基础的化疗疗效的新型预测因子。一方面，在晚期胃癌患者化疗开始之前，可先检测患者HIF-2α、ABCG2、OCT-4 mRNA和蛋白的表达水平，根据表达情况有针对性地选择治疗方案，HIF-2α、ABCG2、OCT-4高表达患者不建议给予FOL-FOX4化疗。另一方面，近年来随着基因治疗热潮的不断涌起，对于HIF-2α、ABCG2、OCT-4基因表达水平较高的患者，亦可以采用反义核苷酸或siRNA基因敲除等技术干扰HIF-2α、ABCG2、OCT-4的表达而逆转耐药，从而实现真正意义上的个体化治疗。

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Correlation of HIF-2α, ABCG2 and OCT-4 with chemotherapy resistance in human gastric cancer

ZHANG Hong-mei1, LIU Xue-jie1, WANG Jing-ya2, ZHANG Xiao-qian1*1Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Weifang Medical University, Weifang 261031, China
2Department of Clinical Medicine, Weifang Medical University, Weifang 261053, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: 13853697396@163.com

, E-mail: 13853697396@163.com
This study was supported by the Science and Technology Program of Shandong Province (2012YD18108) and the Science and Technology Innovation Foundation of the Affiliated Hospital of Weifang Medical University (2012)

ObjectiveTo investigate the correlation of HIF-2α, ABCG2 and OCT-4 with chemotherapy resistant gastric cancer in humans.MethodsFifty-two patients who were confirmed to have advanced gastric cancer with the aid of electronic endoscopy and pathology in the Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Weifang Medical College, were enrolled in the study. According to the effect of FOL-FOX4 chemotherapy that these patients had experienced, they were divided into three groups: CR+PR (complete remission+partial remission) group, SD (stable disease) group and PD (progressive disease) group. The expression levels of HIF-2α, ABCG2, and OCT-4 mRNA and protein were assessed in different groups by using RT-PCR and immunocytochemistry.ResultsTwo patients achieved CR, 19 achieved PR, 25 showed SD, and 6 showed PD. In other words, CR+PR were seen in 21 patients (40.4%), SD in 25(48.1%), PD in 6(11.5%). In CR+PR group, the expression levels of HIF-2α, ABCG2 and OCT4 mRNA and protein were low, but the above mentioned expressions were significantly increased in SD group and PD group. The expression levels of HIF-2α, ABCG2 and Oct-4 mRNA and protein were highest in the PD group, lower in the SD group, and lowest in the CR + PR groups (allP<0.05).ConclusionsThe expression of the markers HIF-2α, ABCG2 and OCT4 in human tumor tissues is related to the effect of chemotherapy for gastric cancer. A high expression of tumor markers is perhaps the main reason for low efficacy of chemotherapy due to drug resistance.

stomach neoplasms; antineoplastic combined chemotherapy protocols; drug resistance, neoplasm

R735.2

A

0577-7402(2015)10-0816-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.10.09

2015-04-19；

2015-07-16)

(责任编辑：熊晓然)

山东省科技发展计划(2012YD18108)；潍坊医学院附属医院前沿探索重点研究基金(2012)

张红梅，副主任医师。主要从事消化道肿瘤的基础与临床研究

261031 山东潍坊 潍坊医学院附属医院消化内科(张红梅、刘学杰、张小茜)；261053 山东潍坊 潍坊医学院临床医学系(王婧雅)

张小茜，E-mail :13853697396@163.com