外科术后肠动力障碍免疫学研究进展

孔剑桥 徐小宏 魏星 孙秋华 裘华森*

外科术后肠动力障碍免疫学研究进展

孔剑桥 徐小宏 魏星 孙秋华 裘华森*

外科术后肠动力障碍（Postoperative ileus，POI）是常见医源性腹部甚至非腹部手术并发症［1］。近年来随着快速康复外科的发展，POI常因延长患者住院时间和增加住院费用而被认为是影响患者术后康复的核心环节。据报道，美国因POI每年耗费近15亿美元，超过处理术后深静脉血栓、肺栓塞和外科术后感染等并发症的费用［2-3］。由于POI发病机制尚未明确，临床上缺乏统一的诊断标准以及有效的治疗药物，因此该领域一直是研究的热点。本文拟从POI免疫学等最新研究进展进行综述，以丰富对POI发病机制的理解，并探索免疫治疗POI新策略。

1 POI的概念和病理生理

研究表明常规腹部手术胃肠道各段的蠕动恢复时间并不相同，小肠蠕动恢复平均约24h，胃为24~48h，而结肠为48~72h［4］。因此，有学者认为外科术后早期肠动力障碍是正常生理现象，仅术后>3d甚至有学者提出>6d才考虑延迟性或病理性肠动力障碍［5］。Kehlet H等［6］复习文献后建议POI从手术开始到术后肛门排气排便且恢复饮食后24h内无腹部不适，并排除术后吻合口瘘、腹腔脓肿和腹膜炎等并发症。Ryash Vather等［2］结合临床提出延迟性外科术后肠道功能障碍（delayed postoperative ileus）和复发性外科术后胃肠功能障碍（recurrence postoperative ileus）的概念和诊断标准，具有一定的临床意义。POI病理生理较为复杂，被认为是多因素相互作用而诱发的结果，如围手术期用药（麻醉药、镇痛药、抗胆碱药），胃肠道激素的变化，水电解质紊乱和手术创伤等。研究表明POI主要诱因还是外科操作本身，其核心的病理改变是小肠平滑肌炎症反应。外科手术时促发胃肠道功能障碍两个动态的病理生理阶段［7］：第一期：神经反射期，一般为术后3h内，手术促发了抑制性神经反射，通过神经末梢释放肾上腺素、NO、VIP等抑制性神经介质而抑制肠道传输功能；第二期：炎症反应期，这期与临床最为相关，是治疗和预防POI最为有效时期，这期持续时间最长，始于手术操作3~4h，术时激活胃肠道肌间神经丛和浆膜层中定居的免疫细胞如巨噬细胞、肥大细胞和树突状细胞等，使中性粒细胞聚集并释放多种细胞因子和化学趋化因子而影响平滑肌细胞收缩［8］。

2 POI时免疫启动、活化及调控

近年研究发现小肠固有免疫和适应性免疫对POI的持续存在起着关键作用。POI时小肠平滑肌层炎症反应主要是固有免疫系统通过模式识别受体（pattern recognition receptors，PRRS）对各种大分子识别而触发，而不是与抗原特异性结合促发。固有免疫系统所识别的大分子可分为病原相关分子模式（pathegen-associated molecular pattern，PAMPs）和损伤相关分子模式 （damage-associated molecular pattern，DAMPs）［9］。PAMPs是病原体或其产物所共有的高度保守的特定分子结构，主要是G-菌表面的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和G+菌表面的肽聚糖、磷壁酸、鞭毛蛋白等，是固有免疫细胞表面或胞内器室膜模式识别受体识别结合的配体，结合后使固有免疫细胞活化。DAMPs又称为“警报素（alarmins）”，包括高机动组盒蛋白-1（High-mobility Group Box Protein-1，HMGB1），尿酸、热休克蛋白、S100蛋白、DNA 和ATP等胞内分子，主要储存在粒细胞和各种上皮细胞中，在机械性外力作用下，损伤或凋亡细胞迅速释放“警报素”，募集和活化具有相应受体的固有免疫细胞。固有免疫细胞表面能与PAMPs和DAMPs相识别的常见受体为Toll样受体（Toll-like Receptors，TLRs）和糖基化终产物受体（Receptor for Advanced Glycation End-products，RAGE）。在这过程中TLR信号调控最受关注。迄今为止，小鼠已识别出12个TLs而人识别出10个TLRs，如当LPS被TLR4识别后激活免疫细胞表达的TLR4受体，引起NF-кB和MAPK表达增加，导致树突状细胞和巨噬细胞等天然免疫细胞分泌各种促炎因子和干扰素（Interferon，IFN），并将抗原提呈给T、B淋巴细胞，调节适应性免疫应答，同时上调抗原提呈细胞（APC）尤其树突状细胞表面的共刺激分子和MHC-Ⅱ分子的表达［10］。Tiruppathi等［11］研究发现转录抑制因子DREAM能抑制A20基因表达，促进TLR4和TNF介导的炎症损伤，而转录因子USF-1可结合A20基因的下游调控元件活化A20的表达。因此，抑制DREAM或增强USF-1可能为治疗或预防平滑肌层炎症反应提供新的途径，而DAMPs激活多种细胞内受体，合成具有活性的IL-1β和IL-18所必需的“炎性复合体”（Inflammasome）［12］。

2 POI肠道免疫细胞的作用

胃肠道中组织定居的巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞和记忆性T细胞等免疫细胞在手术操作促发小肠平滑肌层炎症反应以及炎症的弥散起关键作用。正常条件下胃肠道组织定居巨噬细胞位于肌间神经丛和小肠浆膜层，多数具有吞噬特性，表达能与内毒素相结合的受体CD14，能被LPS所激活，其中肌层巨噬细胞还表达清道夫受体CD163，具有与细菌结合和传感能力［13］。Kalff 等［14］首先证实小鼠手术操作可引起小肠平滑肌层吞噬细胞激活标记淋巴细胞功能相关抗原-1（lymphocyte function- associated antigen-1，LFA-1）染色增多；通过注射包裹氯屈磷酸二钠的脂质体耗竭小鼠巨噬细胞能减少小鼠小肠平滑肌层炎症介质和粘附分子释放以及白细胞的集聚，并恢复术后肠道传输功能，离体空肠环形肌功能和胃肠蠕动也接近正常。另肠道手术损伤释放的DAMPS和细胞因子或进入全身循环的LPS也可以激活巨噬细胞网，导致NF-кB的激活和上调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）表达，如果抗生素预处理POI肠道能改善小肠操作所致的平滑肌层炎症反应［15］。Matteoli等［16］采用基因敲除和骨髓嵌合体小鼠研究发现迷走神经刺激（Vagus nerve stimulation，VNS）可降低胃肠道炎症反应和改善术后肠道功能障碍，实质就是通过胆碱能抗炎通路（Cholinergic anti-inflammatory pathway，CAIP）结合巨噬细胞表面表达的α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nicotinc acetylcholine receptor，α7nAChR）发挥抗炎作用。

肥大细胞起源于骨髓造血祖细胞，经血液循环至小肠等周围组织，与机体适应性免疫有关。肥大细胞除可经传统的IgE介导途径激活，也可被多种细胞因子、激素、免疫球蛋白、神经肽和补体激活。由于肥大细胞在腹部手术促发炎症级联反应中起重要作用，被视为腹腔免疫炎症的“哨兵”［17］。肥大细胞被激活脱颗粒，释放各种组胺、细胞因子和特异性蛋白酶（糜蛋白酶和类胰蛋白酶）等介质，同时使白细胞浸润。对腹腔肠系膜和小肠浆膜肥大细胞进行解剖定位可发现肥大细胞在进入肠壁前常以两个或三个簇状紧贴血管，同时与传入神经纤维非常靠近（<25毫米），因此在解剖结构上肥大细胞易进入肠系膜血管［18］。De Jonge等［19］研究发现肥大细胞生长因子缺失Kit/KitV表型鼠能减轻小肠操作诱导的小肠平滑肌炎症反应，如果采用培养的髓源肥大细胞骨髓重建则小肠平滑肌层炎症反应可恢复。临床也证实手术时肥大细胞可进入腹腔，腹腔肥大细胞蛋白酶浓度以及移位细菌内毒素所诱发的全身炎症反应程度与延迟性POI或复发性POI密切相关［4，20］。肥大细胞稳定剂酮替芬和硫蒽唑能显著抑制腹腔肥大细胞释放介质，减轻术后肠道炎症反应，改善术后胃瘫［19］。在啮齿动物和人类，腹部手术可刺激神经末梢释放各种神经递质如P物质（substance P）、降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、蛋白酶等，可直接激活肥大细胞，使肥大细胞脱颗粒，导致肠黏膜通透性增加、肠腔内细菌及其产物移位，随后激活肠定居巨噬细胞并使转录因子磷酸化，上调炎性基因而影响胃肠蠕动［17］。但Gomez-Pinilla等认为肥大细胞在POI时可能并不起作用，既往研究POI所采用的肥大细胞KitW-sh/W-sh缺陷表型鼠其肠道本身就缺乏Cajal间质细胞，存在异常Kit信号和异常胃肠蠕动，而肥大细胞缺失特异性更强的Cpa3Cre3/ +转基因小鼠（小肠Cajal细胞和胃肠蠕动正常），小肠操作所诱发的肠道炎症反应和延迟性胃肠道障碍与野生型小鼠并无区别［21］。有学者研究发现肥大细胞至少对人类POI是发挥作用的，其在POI中作用可能与动物的种类甚至种系有关，同时还与外科手术方式和所选择的POI模型有关［20，22］。

近年来，肠道树突状细胞（Dentritic Cell，DC）和T细胞在POI中作用越来越受到重视。肠道树突状细胞是一类专职抗原提呈细胞（APCs），是启动、调控和维持免疫应答的核心，膜表面高表达MHC-Ⅱ类分子，能刺激初始T细胞增殖活化分泌细胞因子。Engel研究发现小鼠小肠操作可激活小肠平滑肌层CD11b+和CD103+树突状细胞并分泌IL-12，同时高表达协同刺激分子CD40、CD80和CD86，而且树突状细胞数量可增加约30倍，相对假手术组平滑肌层树突状细胞数量很少［8］。这种术后树突状细胞募集及激活可能与手术创伤、局部炎症反应和或肥大细胞激活后小肠黏膜通透性增加有关。当这些树突状细胞与初始T细胞一起培养时T细胞就主要分泌干扰素-γ （Interferon-γ，IFN-γ），还有少许IL-4和IL-17，表明操作区树突状细胞能诱导T辅助细胞主要分化为Th1而不是Th17和Th2细胞。如术前耗竭树突状细胞，则IL-12分泌下降以及与Th1相关介质的mRNA表达水平也下降，POI症状随之缓解。CD4+T辅助细胞被激活时可提高肠道局部炎症反应。CD4基因敲除鼠小肠操作虽可致小肠平滑肌层局部炎症反应，但炎症相对较轻；OT-Ⅱ转基因鼠T细胞表达特异性卵清蛋白受体，如果耗竭该基因鼠表达激活标志CD25的辅助T细胞可预防POI。而如果耗竭Treg细胞仍会出现POI说明调节性T细胞（Treg细胞）对POI并不起作用。由于小肠操作与POI炎症反应阶段间隔时间一般仅3~4h，而初始Th1细胞激活≥24h，所以只有记忆性Th1细胞才能介导POI。记忆Th1细胞包含预先形成的T-bet，为Th1/Th2 转换开关作用的关键因子，受IL-12刺激后可立即分泌大量的IL-12。T-bet缺陷鼠小肠操作后结肠所有的炎症参数降低，胃肠传输和结肠传提高。

3 全胃肠道功能障碍的促发

虽然基于POI小肠平滑肌层炎症反应学说，利用p38分裂素相关蛋白激酶抑制、肥大细胞稳定剂、外源性IL-10、甘氨酸、α7nAChR配体等药物抗炎，能够改善POI，但均不能解释小肠的局部手术操作所致的局部炎症反应是如何弥散至整个胃肠道，即所谓“区域效应（Field Effect，FE）”。有学者认为POI时神经节阻滞剂胍乙啶和六甲胺可使胃排空正常，认为可能是小肠局部炎症反应促发抑制性肾上腺素能神经反射而弥漫至全胃肠道。但如此并不能解释小肠移植后POI，因为小肠移植时支配胃肠道的神经已切断。2010年Engel DR等［8］首次提及POI时适应性免疫特别是肠壁活化的记忆性Th1细胞在“区域性效应”中的作用。研究发现如果小肠操作前用荧光CFSE标记小肠肌层定居细胞24h后，小肠操作可导致操作区小肠平滑肌层T辅助细胞数量减少而未操作区的结肠平滑肌层可发现小肠操作区CFSE标记的活化Th1细胞，而假手术组未发现有此现象。采用流式细胞仪和免疫荧光显微镜可确定结肠中CFSE标记的细胞为可分泌IFN-γ的CD25+CD9+Th1细胞；而且小鼠门静脉血中也可检测到此类细胞，峰值出现在小肠操作后45min；人类分泌IFN-γ的CCR9+CD45RO+记忆性Th细胞可在腹部手术后1h门静脉血中也可发现，然而非腹部手术未发现有此现象。当记忆性Th1细胞经门静脉血流和淋巴管离开小肠操作区，然后通过CCR9依赖方式再循环迁徙弥散至全胃肠道，迁徙出小肠的75%记忆性CD25+CD9+CD44+Th1细胞可分泌IFN-γ并与炎症促发的TNF-α作用于巨噬细胞，诱导巨噬细胞iNOS表达，产生的一氧化氮直接抑制小肠平滑肌细胞的收缩，如果小肠操作前注射免疫抑制剂FTY-720或IL-12抗体可通过阻滞小肠记忆性Th1细胞迁徙至门静脉而预防POI和区域效应［25］。进一步研究发现激活的树突状细胞和T细胞相互作用主要由CCR7调节。CCR7属于G蛋白偶联受体，是外周树突状细胞激活和迁徙的表面标志，也是次级淋巴器官中T细胞迁徙的标志，可调控记忆T细胞浸入炎症组织，促进树突状细胞的成熟和迁徙；CCR7基因敲除鼠小肠及结肠传输增加同时会降低结肠区域效应，也通过抑制激活的树突状细胞和T细胞从空肠迁徙至结肠而间接影响预防非肠道手术所致的POI。

4 讨论

目前认为，POI在促发和维持过程中固有免疫和适应性免疫均居于关键的“枢纽”环节，胃肠道损伤以及随之的肠道细菌移位是促发小肠平滑肌层炎症反应的主要诱因，因此减少小肠免疫应答和炎症级联反应是治疗POI的关键。但是，目前在POI干预研究中尚存在下列问题：（1）缺乏国际公认的POI临床诊断标准，很难评估POI临床发病率和明确危险因子甚至临床试验的比较［2］。（2）传统POI大鼠模型创伤偏轻，研究发病机制和药物干预所选择的观察指标大多在48h内，不能反应临床上关注的延迟性肠道功能障碍病理生理改变。（3）近年来，许多选择性抗炎主要集中在单一的炎症介质，虽然实验时对POI有效，但真正得到临床验证并广泛推广应用的仍较少。因此，加强对POI的发病机制的研究，针对性进行有效的干预治疗依然是亟待解决的重要问题。

［1］ Mattei P, Rombeau JL. Review of the pathophysiology and management of postoperative ileus. World J Surg, 2006, 30(8): 1382-1391.

［2］ Vather R, Trivedi S, Bissett I. Defining postoperative ileus: results of a systematic review and global survey. J Gastrointest Surg, 2013, 17(5):962-972.

［3］ Boeckxstaens GE, De Jonge WJ. Neuroimmune mechanisms in postoperative ileus. Gut, 2009, 58(9):1300-1311.

［4］ De Winter BY, De Man JG. Interplay between inflammation, immune system and neuronal pathways: effect on gastrointestinal motility. World J Gastroenterol, 2010, 16(44):5523-5535.

［5］ Artinyan A, Nunoo-Mensah JW, Balasubramaniam S, et al. Prolonged postoperative ileus-definition, risk factors, and predictors after surgery. World J Surg, 2008, 32(7):1495-1500.

［6］ Kehlet H. Postoperative ileus--an update on preventive techniques. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol, 2008, 5(10):552-558.

［7］ Gao Z, Müller MH, Karpitschka M, et al. Role of the vagus nerve on the development of postoperative ileus. Langenbecks Arch Surg, 2010, 395(4):407-411.

［8］ Engel DR, Koscielny A, Wehner S, et al. T helper type 1 memory cells disseminate postoperative ileus over the entire intestinal tract. Nat Med, 2010, 16(12):1407-1413.

［9］ Lotze MT, Zeh HJ, Rubartelli A, et al. The grateful dead: damageassociated molecular pattern molecules and reduction/oxidation regulate immunity. Immunol Rev, 2007, 220:60-81.

［10］ Stoffels B, Hupa KJ, Snoek SA, et al. Postoperative ileus involves interleukin-1 receptor signaling in enteric glia. Gastroenterology, 2014, 146(1):176-187.

［11］ Tiruppathi C, Soni D, Wang DM, et al. The transcription factor DREAM represses the deubiquitinase A20 and mediates inflammation. Nat Immunol, 2014, 15(3):239-247.

［12］ Maslanik T, Mahaffey L, Tannura K, et al. The inflammasome and danger associated molecular patterns (DAMPs) are implicated in cytokine and chemokine responses following stressor exposure. Brain Behav Immun, 2013, 28:54-62.

［13］ Fabriek BO, Van Bruggen R, Deng DM, et al. The macrophage scavenger receptor CD163 functions as an innate immune sensor for bacteria. Blood, 2009, 113(4):887-892.

［14］ Wehner S, Behrendt FF, Lyutenski BN, et al. Inhibition of macrophage function prevents intestinal inflammation and postoperative ileus in rodents. Gut, 2007, 56(2):176-185.

［15］ Türler A, Schnurr C, Nakao A, et al. Endogenous endotoxin participates in causing a panenteric inflammatory ileus after colonic surgery. Ann Surg, 2007, 245(5):734-744.

［16］ Matteoli G, Gomez-Pinilla PJ, Nemethova A, et al. A distinct vagal anti-inflammatory pathway modulates intestinal muscularis resident macrophages independent of the spleen. Gut, 2014, 63(6):938-948.

［17］ Snoek SA, Dhawan S, Van Bree SH, et al. Mast cells trigger epithelial barrier dysfunction, bacterial translocation and postoperative ileus in a mouse model. Neurogastroenterol Motil, 2012, 24(2):172-184.

［18］ Chatterjee V, Gashev AA. Mast cell-directed recruitment of MHC class II positive cells and eosinophils towards mesenteric lymphatic vessels in adulthood and elderly. Lymphat Res Biol, 2014, 12(1):37-47.

［19］ De Jonge WJ, The FO, Van der Coelen D, et al. Mast cell degranulation during abdominal surgery initiates postoperative ileus in mice. Gastroenterology, 2004, 127(2):535-545.

［20］ Berdún S, Bombuy E, Estrada O, et al. Peritoneal mast cell degranulation and gastrointestinal recovery in patients undergoing colorectal surgery. Neurogastroenterol Motil, 2015, 27(6):764-774.

［21］ Gomez-Pinilla PJ, Farro G, Di GM, et al. Mast cells play no role in the pathogenesis of postoperative ileus induced by intestinal manipulation. PLoS One, 2014, 9(1):e85304.

［22］ Peters EG, De Jonge WJ, Smeets BJ, et al. The contribution of mast cells to postoperative ileus in experimental and clinical studies. Neurogastroenterol Motil, 2015, 27(6):743-749.

国家自然科学基金（81173425，81470194）；浙江省教育厅基金（Y2014311247）

310053 浙江中医药大学第一临床学院（孔剑桥 裘华森）

310006 浙江中医药大学附属第一医院（徐小宏 魏星）

310053 浙江中医药大学（孙秋华）

*通信作者