桑蚕茧丝素蛋白肽对大鼠离体过氧化肝组织的修复及对小鼠过氧化肝损伤的预防作用观察

王美飒，黄慧明，朱仲玲，杜怡波，杜双双，赵红平，阎昭

(1天津医科大学肿瘤医院，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060；2清华大学生物力学与医学工程研究所)

桑蚕茧丝素蛋白肽对大鼠离体过氧化肝组织的修复及对小鼠过氧化肝损伤的预防作用观察

王美飒1，黄慧明2，朱仲玲1，杜怡波1，杜双双1，赵红平2，阎昭1

(1天津医科大学肿瘤医院，天津市肿瘤防治重点实验室，天津300060；2清华大学生物力学与医学工程研究所)

目的 观察桑蚕茧丝素蛋白肽(SFP)对大鼠离体过氧化肝组织的修复作用及对小鼠过氧化肝损伤的预防作用。方法 ①SFP对离体大鼠过氧化肝组织抗氧化作用观察：Sprague-Dawley大鼠3只，处死后制备肝微粒体，加入抗坏血酸和亚铁离子溶液诱导过氧化后分为5个组，实验1、2、3组分别加入10、15、30 μg/mL的SFP，阳性对照组加入10 μg/mL的抗氧化剂BHT，空白对照组加入PBS缓冲液；37 ℃水浴孵育2 h后检测丙二醛(MDA)，计算各组过氧化抑制率。②SFP对小鼠过氧化肝损伤的干预作用观察：选取BALB/c健康成年小鼠50只，随机分为A、B、C、D、E组。A、B、C组分别注射37.5、75、112.5 mg/kg的SFP、1次/d，D组注射生理盐水、1次/d，E组常规饲养；给药33 d后将小鼠饥饿过夜，按上述方法给药0.5～1 h后，A、B、C、D组以溴代苯油灌胃制作过氧化肝损伤模型，24 h后处死5组动物，取小鼠肝组织，检测血清及肝组织中的MDA、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)。在实验过程中，每天记录小鼠体质量，观察小鼠精神、饮食及活动状况。结果 实验1、2、3组及阳性对照组肝组织中MDA含量均低于空白对照组，且实验1、2、3组肝组织中MDA含量逐渐降低(P均<0.05)。实验1、2、3组脂质过氧化抑制率逐渐升高，且均低于阳性对照组(P均<0.05)。A、B、C组血清及肝组织中MDA含量低于D、E组，SOD、GSH-Px活性高于D、E组；A、B、C组血清及肝组织中MDA含量逐渐降低，SOD、GSH-Px活性逐渐升高(P均<0.05)。实验过程中，小鼠均未出现消瘦、精神萎靡甚至死亡的情况。结论 SFP对大鼠离体过氧化肝组织有修复作用，并可预防小鼠过氧化肝损伤，作用呈一定剂量相关性，其机制可能与减少过氧化产物生成、提高抗氧化酶活性有关。

桑蚕茧；丝素蛋白肽；过氧化肝损伤；丙二醛；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽过氧化物酶

桑蚕茧是由家蚕吐丝结茧而成的一种传统中药材，其丝胶蛋白含量约25%，丝素蛋白含量约75%。《本草纲目》描述桑蚕茧气味为甘、温、无毒，现代药理研究[1～6]表明其具有明确的抗肿瘤、防血栓、降血压、降血糖和拟胆碱作用，如宝心艾维西木口服液(治疗心血管疾病)、复方西红花口服液(养心温胃、补肾强身)及复方高滋斑片(强心健脑、安神通脉)中均含有桑蚕茧。为进一步拓展桑蚕茧的临床应用，研究者逐步关注桑蚕茧的抗氧化活性。已有研究[7]表明，桑蚕茧中丝胶蛋白具有良好的抗氧化活性，而对于桑蚕茧中含量较高的丝素蛋白的抗氧化活性目前鲜有报道。基于此，我们制备了高纯度、高浓度的丝素蛋白肽(SFP)，观察SFP对大鼠离体过氧化肝组织的修复作用及对小鼠过氧化肝损伤的预防作用，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要材料 实验动物：雄性一级Sprague-Dawley大鼠3只，体质量180～220 g；雄性BALB/c小鼠50只、体质量18～22 g，许可证号SCXK(京)2011-0011，在SPF级动物房饲养。药物与试剂：SFP，生理盐水，蔗糖，Tris，盐酸，PBS缓冲液(pH 7.4)，三氯醋酸(TCA)，抗坏血酸(维生素C)，FeSO4·7H2O，2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)，2,2′-二苯基-1-苦肼基(DPPH)，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)与谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒。仪器：酶标仪，低温高速离心机。

1.2 SFP对大鼠离体过氧化肝组织的修复作用观察

1.2.1 大鼠过氧化肝组织制作及SFP的应用 将3只Wistar雄性大鼠禁食不禁水过夜，断头处死，待血液放尽后立即取出全部肝脏，用预冷的生理盐水清洗血污，滤纸吸干，将肝脏称重后剪碎；每1 g肝脏加入4 mL预先配好的0.25 mol/L的蔗糖-Tirs-HCl缓冲液(pH 7.4)，用匀浆机匀浆肝脏，用差速离心法制备一级Sprague-Dawley大鼠肝微粒体沉淀，随后加入0.15 mol/L的KCl，得到1 mg/mL的肝微粒混悬液；取5个洁净离心管，在各管中加入0.8 mL的PBS缓冲液与0.2 mL的肝微粒悬液，37 ℃预孵育5 min；加入抗坏血酸和亚铁离子溶液诱导肝微粒体发生过氧化。每管作为1个组，共5个组。实验1、2、3组分别加入10、15、30 μg/mL的SFP 0.2 mL，阳性对照组加入10 μg/mL的抗氧化剂BHT 0.2 mL，空白对照组加入生理盐水0.2 mL，继续培养。

1.2.2 过氧化肝组织中MDA检测及过氧化抑制率的测算 ①MDA检测：各组肝组织放置在37 ℃水浴锅内恒温孵育2 h，将各管取出放置于冰盒中，加入10%的三氯乙酸溶液3 mL终止反应，冰浴15 min后取出，4 000 r/min下离心10 min，使用MDA试剂盒检测MDA。②过氧化抑制率测算：在532 nm波长下检测吸光度值，过氧化抑制率=(各组吸光度值/空白对照组吸光度值)×100%。

1.3 SFP对小鼠过氧化肝损伤的预防作用观察 选取18～22 g BALB/c健康成年小鼠50只，随机分为A、B、C、D、E组。A、B、C组分别注射37.5、75、112.5 mg/kg的SFP 0.2 mL、1次/d，D组注射生理盐水0.2 mL、1次/d；E组常规饲养。给药33 d后将小鼠饥饿过夜，按上述方法给药0.5～1 h后，A、B、C、D组参考卫生部保健食品检验与评价技术规范(2003年版)中溴代苯模型制造方法制作过氧化肝损伤模型(给予0.45 mg/kg、20 mL/20 g溴代苯油灌胃)。24 h后处死5组动物，取小鼠肝组织，检测血清及肝组织中的MDA、SOD、GSH-Px。在实验过程中，每天用电子天平称量并记录小鼠的体质量，每天观察小鼠的精神、饮食及活动状况。

2 结果

2.1 SFP体外对大鼠肝组织的抗氧化作用 实验1组、实验2组、实验3组、阳性对照组、空白对照组肝组织中MDA含量分别为(11.7±1.05)、(10.9±0.36)、(10.2±0.10)、(4.2±0.08)、(14.1±0.50)nmol/L。实验1、2、3组及阳性对照组肝组织中MDA含量均低于空白对照组，且实验1、2、3组肝组织中MDA的含量逐渐降低(P均<0.05)。实验1组、实验2组、实验3组、阳性对照组脂质过氧化抑制率分别为17%、23%、28%、84%，实验1、2、3组脂质过氧化抑制率逐渐升高，且均低于阳性对照组(P均<0.05)。

2.2 SFP对小鼠过氧化肝损伤的干预作用 各组小鼠血清及肝组织中MDA含量及SOD、GSH-Px活性比较见表1。A、B、C组血清及肝组织中MDA含量低于D、E组(P均<0.05)。A、B、C组血清及肝组织中SOD、GSH-Px活性高于D、E组(P均<0.05)。小鼠体质量变化见表2。A、B、C组组内无统计学差异。在第34天，各小鼠体质量较前有所下降。实验过程中，各组小鼠生长状态良好，精神饱满，正常饮食，无其他不良反应出现。

表1 各组小鼠血清及肝组织中MDA含量及SOD、GSH-Px活性比较

注：与E组比较，*P<0.05；与D组相比，#P<0.05。

表2 各组小鼠实验第1～35天体质量变化

3 讨论

近年来国内桑蚕产茧量连续递增[8]，桑蚕茧原料极其丰富。桑蚕茧主要由丝素蛋白和丝胶蛋白组成，其中丝素蛋白是桑蚕茧蚕丝蛋白的主要组成部分，约占蛋白总量的70%。桑蚕茧丝素蛋白可通过水解或酶解等方法降解为SFP。SFP被广泛应用到医药、食品与化妆品等领域[9]。随着研究不断深入，学者们逐渐发现SFP的抗氧化、抗肿瘤的潜在药用价值。

现代药理学研究表明，心血管疾病等慢性疾病与自由基、脂质过氧化等有密切关系[10]。自由基是人体正常代谢产物，机体主要通过呼吸链内氧化磷酸途径、精氨酸-NO合成酶途径、黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶途径等多条反应途径产生自由基[11]。生理情况下，人体内存在的少数自由基可促进嗜酸性细胞杀灭细菌，控制炎症反应[11]，且机体内产生的自由基可被抗氧化防御系统有效清除，以维持自由基产生与消除的动态平衡。病理情况下，机体内由于自由基聚集，会发生脂质过氧化反应，诱导细胞凋亡及各种慢性疾病的产生，如关节炎[12]、糖尿病[13]、高血压、恶性肿瘤等[14,15]。

氧自由基是造成肝损伤的最常见原因之一，氧自由基可进攻生物膜中的多种不饱和脂肪酸，从而引起脂质过氧化反应，生成MDA等脂质过氧化物，MDA是细胞脂质过氧化反应的标志物，可以间接反映细胞及组织损伤的程度[16]。MDA可诱导膜系统发生脂质过氧化反应，使膜磷脂大量降解，从而破坏生物膜结构的完整性，引起膜通透性增高，最终导致细胞死亡，造成肝损伤。SOD和GSH-Px是生物体内重要的抗氧化酶，也是评估肝脏抗氧化水平的重要指标。SOD的生物学作用是清除超氧化物自由基，它是体内惟一可以消耗超氧化物自由基的酶，也是机体清除自由基的第一道防线[17]。当机体产生大量自由基时，体内会生成大量SOD，从而提高机体处理自由基的能力，抑制过氧化反应[18]。GSH-Px的主要生物学作用是清除脂质过氧化物、防止畸变等[19]。因此，本研究建立过氧化肝损伤模型，通过检测MDA、SOD和GSH-Px，验证SFP的抗氧化作用[20]。

本研究首先观察了SFP对离体过氧化肝组织的抗氧化活性，结果显示，实验1、2、3组及阳性对照组肝组织中MDA含量低于空白对照组，实验1、2、3组肝组织中MDA含量高于阳性对照组；实验1、2、3组脂质过氧化抑制率及自由基清除率低于阳性对照组，实验1、2、3组脂质过氧化抑制率及自由基清除率逐渐升高。上述结果提示SFP可减少脂质过氧化产物MDA生成，并能提高氧自由基的清除率，且呈量效关系；SFP的体外抗氧化能力逊于BHT，但BHT对人体有害，而SFP为无毒级，生物安全性远优于BHT。

在体内实验中，我们以溴代苯诱导建立过氧化肝损伤小鼠模型来验证SFP的抗氧化功能。溴代苯可导致小鼠肝中毒，引起肝脂质过氧化。本研究结果显示，A、B、C组血清及肝组织中MDA含量低于D、E组，SOD、GSH-Px活性高于D、E组；A、B、C组血清及肝组织中MDA含量逐渐降低，SOD、GSH-Px活性逐渐升高。这说明SFP可减轻过氧化肝损伤程度，减少MDA生成，提高SOD、GSH-Px活性，且具有一定的量效关系。在实验过程中，小鼠均未出现消瘦、精神萎靡甚至死亡的情况，表明SFP体内应用较安全。

上述研究结果表明，SFP对大鼠离体过氧化肝组织有修复作用，并可预防小鼠过氧化肝损伤，其机制可能与减少过氧化产物生成、提高抗氧化酶活性有关。这为中药材桑蚕茧临床干预或治疗糖尿病、高血压、心血管等疾病提供了实验基础。然而，SFP的具体作用机制还有待深入研究，SFP的临床应用及其确切效果仍需更多探索和验证。

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Effects of silk protein polypeptides of silkworm cocoon on repairing isolated oxidative livertissues in rats and its preventive effect on oxidative liver injury in mice

WANGMeisa1,HUANGHuiming,ZHUZhongling,DUYibo,DUShuangshuang,ZHAOHongping,YANZhao

(1TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy,Tianjin300060,China)

Objective To observe the effect of silk protein polypeptides of silkworm cocoon (SFP) on repairing oxidative liver tissues in rats and its preventive effect on oxidative liver injury in mice.Methods ①Anti-oxidation effect of SFP on the isolated rat liver: three Sprague-Dawley rats were sacrificed and prepared the liver microsomes, after adding ascorbic acid and ferrous ion solution to induce oxidation, they were divided into 5 groups, 0.2 mL SPF was added to the experimental groups 1, 2 and 3 with concentrations of 10, 15 and 30 μg/mL, respectively, the equal amount of 10 μg/mL antioxidant BHT and distilled water were added to the positive control group and blank control group, respectively. We measured the content of MDA and calculated the inhibition rate of oxidation after incubation in 37 ℃ water for 2 h. ② Intervention effect of SFP on liver injury induced by oxidation in mice: Fifty healthy BALB/C mice were randomly divided into groups A, B, C, D and E. Mice in the groups A, B and C were injected with 37.5, 75 and 112.5 mg/kg SFP once a day; mice in the group D were injected with normal saline once a day and in group E were fed normally. After 33-day administration, mice were starved overnight and injected as described above, after 0.5-1 h mice in the groups A, B, C and D were given brominated oil to produce the liver injury models by oxidation. After 24 h, mice were sacrificed and we took the liver tissues to measure MDA, SOD and GSH-Px. In the experiment process, we recorded the body weight of mice every day and observed the spirit, diet and activity of mice.Results The content of MDA in the liver tissues of the experimental groups 1, 2, 3 and positive control group was lower than that of the blank control group, and the MDA content in the experimental groups 1, 2 and 3 was decreased gradually (allP<0.05). The inhibition rates of lipid peroxidation in the experimental groups 1, 2 and 3 were increased gradually and they were all lower than that of the positive control group (allP<0.05). The contents of MDA in serum and liver tissues of groups A, B and C were lower than those in the groups D and E, and the activity of SOD and GSH-Px in serum and liver tissues was higher than that of groups D and E. The contents of MDA in the groups A, B and C were reduced, while the activity of SOD and GSH-Px was increased gradually (allP<0.05). During the experiment, the mice did not appear weight loss, mental malaise or even death.Conclusions SFP could repair the oxidative liver injury of rats in vitro and prevent liver injury in mice, which is in a dose-dependent manner. The effect of SFP on liver injury may be related to reducing the formation of peroxidation products and improving antioxidant enzyme activity.

silkworm cocoon; fibroin polypeptides; oxidative liver injury; malondialdehyde; superoxide dismutase; glutathione peroxidase

科技部十二五“重大新药创制”科技重大专项课题(2013ZX09303001)。

王美飒(1992-)，女，硕士研究生，主要研究方向为肿瘤临床药理学。E-mail： sasatjmu@163.com

阎昭(1973-)，男，主任药师，主要研究方向为肿瘤临床药理学。E-mail： yanzhaopaper@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.03.007

R575

A

1002-266X(2017)03-0025-04

2016-07-27)